編者按：本欄目為靈賦拓普生物《科研無(wú)止境·我與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物那些事兒》入選作品展示系列，分享來(lái)自各個(gè)科研單位、醫(yī)院高校、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心等科研老師們的優(yōu)秀作品。科研是一場(chǎng)無(wú)止境的探索，歡迎各位老師投稿，分享自己在日常科研中的感想，我們期待與更多的動(dòng)物科研同行攜手并進(jìn)，創(chuàng)造生命科學(xué)領(lǐng)域更美好的明天。
袁晨晨
（揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科胰腺中心）
無(wú)知無(wú)畏，歪打正著
在新冠肆虐的2020年春季，我的導(dǎo)師南京大學(xué)的李維勤教授把肝臟表達(dá)脂蛋白脂酶（LPL）基因?qū)嶒?yàn)性治療LPL基因缺陷引發(fā)嚴(yán)重高甘油三酯血癥的課題交給了我。由于種種原因，大半年過(guò)去了，一只LPL基因缺陷的小鼠都沒(méi)有繁殖出來(lái)，合作單位-五加和基因公司給我們提供的腺相關(guān)病毒（AAV）-LPL在我手中毫無(wú)用處。眼看著畢業(yè)日期一天天逼近，我陷入了焦慮、懷疑和自我否定的負(fù)面情緒中。雖然導(dǎo)師及時(shí)發(fā)現(xiàn)并開(kāi)導(dǎo)我，但實(shí)驗(yàn)不能啟動(dòng)我怎樣才能畢業(yè)呢？
因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)室主要研究高甘油三酯引起的急性胰腺炎，除了LPL基因缺陷的小鼠會(huì)發(fā)生高甘油三酯血癥，我們還有一種GPIHBP1（GPI，糖基化磷脂酰肌醇錨定高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1）基因敲除的小鼠，這種小鼠很容易繁殖。GPI是一種結(jié)合LPL的蛋白，分布在血管內(nèi)皮上。如果沒(méi)有GPI，LPL就不能水解血漿甘油三酯，因此也會(huì)引發(fā)高甘油三酯血癥，但在離乳后才發(fā)生。夜不能寐中，我突發(fā)奇想，反正都是高甘油三酯，把AAV-LPL給GPI缺陷的小鼠靜脈注射后肝臟去表達(dá)，說(shuō)不定也能降低甘油三酯呢。我叫醒了室友，告訴他我的想法。他即使在半睡半醒中，一句話就甩過(guò)來(lái)了，A基因缺陷用B基因來(lái)治，腦子進(jìn)水了嗎？我接著查了幾篇基因治療的文章，的確都是A基因缺陷用A基因來(lái)治，B基因缺陷用B基因來(lái)治。我本來(lái)還想去找導(dǎo)師商量的，這樣一來(lái)我就只能捫在心里了。但是這個(gè)想法一旦形成就反復(fù)地折磨著我。正好那幾天有一批GPI敲除的小鼠要淘汰，我就拿了幾只，把AAV-LPL從尾靜脈中注射了進(jìn)去。一個(gè)星期后，從小鼠的眶靜脈取血離心后一看，沒(méi)有打AAV-LPL小鼠的血漿依然像牛奶一樣，是乳白色的。而那幾只打了AAV-LPL小鼠的血漿居然清亮的像啤酒一樣，其中的甘油三酯竟然降低到了正常小鼠的水平。

我沉住氣又等了一周繼續(xù)取血檢查，仍然是同樣結(jié)果，于是我告訴了導(dǎo)師。他也同樣難以置信，說(shuō)GPI的基因缺陷怎么能用LPL來(lái)矯正呢？于是我們和合作單位開(kāi)了一個(gè)線上會(huì)議。北大醫(yī)學(xué)部的劉國(guó)慶教授是研究LPL的專家，看到結(jié)果后也同樣很震驚。討論后先讓我用一批GPI敲除的小鼠給以不同的AAV-LPL劑量，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)。同時(shí)我們查閱文獻(xiàn)、咨詢其它專家，屆時(shí)再來(lái)分析這種結(jié)果的原因。

深入分析，探索原因
重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，AAV-LPL可以劑量依賴性地矯正GPI缺陷小鼠的嚴(yán)重高甘油三酯血癥。GPI基因缺陷的小鼠LPL的生成是正常的，但是不能被GPI結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞血管面上，并錨定在那里水解血漿中的甘油三酯，因此GPI缺陷的小鼠和病人都發(fā)生高甘油三酯血癥。但是GPI缺陷和LPL缺陷小鼠有一個(gè)顯著不同是LPL缺陷小鼠出生就是高甘油三酯，且兩三天之后就死亡了；而GPI缺陷小鼠出生時(shí)沒(méi)有明顯高甘油三酯，直到離乳后才發(fā)生高甘油三酯。鑒于血漿甘油三酯都是LPL水解的，這就表明在離乳前即使沒(méi)有GPI，LPL也能水解血漿甘油三酯。這是為什么呢？LPL不是需要GPI轉(zhuǎn)運(yùn)到血管內(nèi)皮表面才能水解甘油三酯嗎？難道哺乳期小鼠的LPL就不需要GPI轉(zhuǎn)運(yùn)嗎？這是一個(gè)很令人不解的問(wèn)題。
在第二次線上會(huì)議我提出了這個(gè)問(wèn)題。劉老師說(shuō)他記得在瑞典做博士研究時(shí)，他的導(dǎo)師曾經(jīng)應(yīng)用原為雜交技術(shù)研究過(guò)不同物種LPL的時(shí)空表達(dá)，說(shuō)小鼠和其它動(dòng)物不一樣，肝臟會(huì)在哺乳期表達(dá)LPL，但成年后就不表達(dá)了，而肌肉和脂肪組織仍然表達(dá)。并說(shuō)GPI小鼠哺乳期沒(méi)有高甘油三酯很可能與肝臟表達(dá)LPL有關(guān)，當(dāng)成年后肝臟不表達(dá)LPL了，血漿甘油三酯就不能被水解而發(fā)生高甘油三酯血癥。
可是問(wèn)題來(lái)了，即使肝臟表達(dá)LPL，沒(méi)有GPI的話LPL同樣不能轉(zhuǎn)運(yùn)到血管內(nèi)皮表面水解血漿甘油三酯。我的導(dǎo)師是普外科專家，對(duì)肝臟的結(jié)構(gòu)很熟悉，他說(shuō)肝臟中肝血竇的毛細(xì)血管內(nèi)皮和其它組織毛細(xì)血管的緊密連接不一樣，是疏松連接；內(nèi)皮下還有狄氏腔隙，這樣可以保證血漿中需要代謝的大分子很容易穿過(guò)毛細(xì)血管和肝細(xì)胞直接接觸。也就是說(shuō)，如果肝細(xì)胞表達(dá)LPL，就有可能不需要轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)血管表面就能和血漿中攜帶甘油三酯的脂蛋白發(fā)生相互作用。
但是還有一個(gè)問(wèn)題，就是即使肝細(xì)胞表達(dá)的LPL不需要轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)血管內(nèi)皮就可以分解血漿甘油三酯，那么在沒(méi)有GPI情況下，LPL是怎樣錨定在肝細(xì)胞表面水解血漿甘油三酯的呢？
帶著這些問(wèn)題，我先應(yīng)用定量PCR檢測(cè)了新生、哺乳期、成年后GPI缺陷小鼠和大鼠的肝臟LPL表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)的確小鼠的肝臟在新生期、哺乳期LPL基因表達(dá)水平比成年期高50多倍，而新生和哺乳期的大鼠肝臟和成年期一樣幾乎不表達(dá)LPL，因此大鼠出生后就發(fā)生嚴(yán)重的高甘油三酯血癥，而且新生和哺乳期死亡率很高。然后我檢測(cè)了靜脈注射AAV-LPL在各個(gè)組織的分布，發(fā)現(xiàn)95%以上的外源性LPL都表達(dá)在肝臟。接著我們又做了外源性LPL在肝臟的免疫熒光，證實(shí)LPL分布在肝細(xì)胞的表面而不是血管內(nèi)皮上。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞表面有與GPI結(jié)構(gòu)相似的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG），而且豐度很高。這樣我們就做了HSPG和LPL的共定位，證實(shí)外源性LPL和肝臟HSPG共同定位在肝細(xì)胞表面。我們后來(lái)又在GPI缺陷小鼠上補(bǔ)充做了AAV-LPL在肌肉的表達(dá)，結(jié)果LPL不能到達(dá)血管內(nèi)皮表面，而且對(duì)血漿甘油三酯沒(méi)有影響。

擴(kuò)大成果，圓滿收官
顯然，體內(nèi)沒(méi)有GPI時(shí)，肝細(xì)胞表面的HSPG能夠替代GPI錨定LPL，而血漿可以通過(guò)肝血竇毛細(xì)血管的疏松連接，因此血漿甘油三酯能夠被肝細(xì)胞表面的LPL水解；肌肉和脂肪細(xì)胞雖然能產(chǎn)生LPL，并被HSPG錨定在肌肉和脂肪的細(xì)胞表面，但不能轉(zhuǎn)運(yùn)到毛細(xì)血管內(nèi)皮的血管面。而血漿不能通過(guò)肌肉和脂肪組織的毛細(xì)血管壁，因此血漿中的甘油三酯無(wú)法在肌肉和脂肪組織中被水解。這樣我歪打正著得到的肝臟表達(dá)A基因能矯正B基因缺陷所致高甘油三酯血癥的結(jié)果，就得到了合理的解釋。
回答了科學(xué)問(wèn)題后，我們還將AAV-LPL的肝臟異位表達(dá)方法應(yīng)用于GPI缺陷的成年和新生期大鼠，不僅糾正了大鼠的嚴(yán)重高甘油三酯血癥，還減低了新生大鼠的死亡率。我們進(jìn)一步在接受AAV-LPL和沒(méi)有接受的GPI缺陷小鼠體內(nèi)通過(guò)給以雨蛙素誘發(fā)急性胰腺炎，證明肝臟異位表達(dá)LPL能夠防止急性胰腺炎的發(fā)生，有可能作為一種新的治療方法應(yīng)用于GPI基因突變導(dǎo)致嚴(yán)重高甘油三酯血癥發(fā)生急性胰腺炎的患者。


在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，我們總結(jié)了這些數(shù)據(jù)，寫(xiě)成了一篇“AAV-mediated hepatic LPL expression ameliorates severe hypertriglyceridemia and acute pancreatitis in Gpihbp1 deficient mice and rats”論文（AAV介導(dǎo)的肝臟LPL表達(dá)治療GPIHBP1缺陷小鼠和大鼠的嚴(yán)重高甘油三酯血癥和急性胰腺炎），投寄到了基因治療領(lǐng)域的權(quán)威期刊Molecular Therapy。兩周后我們收到了主編的回復(fù)，讓我們補(bǔ)充一些關(guān)于毒性研究和基因產(chǎn)物代謝數(shù)據(jù)，并修改一下英語(yǔ)的表達(dá)方式，并回答幾個(gè)有關(guān)AAV載體構(gòu)建的問(wèn)題。完成了這些工作再投回去，編輯部很快就通知我們文章接受了，于2023年11月在線發(fā)表（https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.018.）。當(dāng)然我也順利地通過(guò)答辯畢業(yè)了。不過(guò)我心里總覺(jué)得有些對(duì)不起GPI缺陷的小鼠，是我當(dāng)時(shí)的無(wú)知，讓它們獻(xiàn)身到了LPL肝臟異位表達(dá)的基因治療實(shí)驗(yàn)中。