技術(shù)簡介

細(xì)胞永生化是指體外分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞受到自發(fā)的或受外界因素的影響，避免了正常細(xì)胞的衰老死亡過程，從而具有無限增殖能力的過程。衰老死亡是一種正常的不可逆的細(xì)胞生理過程，正常組織來源的原代細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但細(xì)胞在不斷增殖分裂的過程中會達(dá)到衰老M1期和致死M2期，細(xì)胞會停止分裂并啟動凋亡過程。此時如果細(xì)胞在某些原因誘導(dǎo)下，恢復(fù)基因的穩(wěn)定性，則可以逃離衰老死亡的正常生理過程達(dá)到無限增殖分裂的永生化狀態(tài)。利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi)，從而建立永生化細(xì)胞株，以達(dá)到使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無限增殖能力且細(xì)胞間無差異的目的。

哺乳動物細(xì)胞使用幾種方法誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。其中猿猴病毒40（SV40）T抗原和hTERT病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞永生化最為簡單可靠，應(yīng)用廣泛。

SV40 T抗原

SV40主要由大T、小T和結(jié)構(gòu)蛋白組成。SV40的大T抗原片段常用于整合入宿主細(xì)胞基因組并表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞周期，致使細(xì)胞進(jìn)入無限增殖的永生化狀態(tài)。目前對SV40轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞進(jìn)入永生化的機(jī)制推測可能是SV40大T抗原片段與p53蛋白及其相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合體導(dǎo)致p53蛋白失活，使抑癌基因失效無法表達(dá)，從而防止細(xì)胞分裂停滯，調(diào)整宿主細(xì)胞周期，從而永生化。

端粒-端粒酶激活

端粒是維持染色體穩(wěn)定、細(xì)胞壽命的重要結(jié)果，其長度與染色體復(fù)制次數(shù)成反比，由于端粒長短有限，一旦減少到極值，便不再具有保護(hù)染色體穩(wěn)定的作用，隨之發(fā)生細(xì)胞死亡。但是端粒中含有一種逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉(zhuǎn)錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補(bǔ)端粒的長度，使細(xì)胞持續(xù)生長。但是TERT通常在正常的真核細(xì)胞中是不被表達(dá)的，需要轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段，構(gòu)建真核表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼而實現(xiàn)細(xì)胞永生化。

    操作流程

   服務(wù)內(nèi)容

1.  原代細(xì)胞分離純化；

2.  永生化基因的慢病毒制備；

3.  慢病毒感染原代細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

4.  永生化混合細(xì)胞進(jìn)行抗生素篩選；

5.  永生化細(xì)胞系進(jìn)行端粒酶基因表達(dá)和衰老檢測。

   增值服務(wù)

1.  永生化細(xì)胞核型分析

2.  流式檢測表面蛋白標(biāo)記

3.  干細(xì)胞畸胎瘤形成檢測實驗

   項目案例

  以人間充質(zhì)干細(xì)胞為例，展示永生化細(xì)胞制備、鑒定的相關(guān)結(jié)果

（1）     細(xì)胞形態(tài)圖（抗生素篩選）

（2）     端粒酶表達(dá)檢測

（3）     衰老檢測