近日，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系李學(xué)農(nóng)教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際權(quán)威期刊《Molecular Cancer》（中科院SCI分區(qū)小類1區(qū)，影響因子41.44）上刊發(fā)了題為“circEXOC6B interacting with RRAGB, an mTORC1 activator, inhibits the progression of colorectal cancer by antagonizing the HIF1ARRAGBmTORC1 positive feedback loop”的研究論文。該文作者通過高通量測(cè)序篩選及qPCR等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了在結(jié)直腸癌顯著下調(diào)的環(huán)狀RNA circEXOC6B，闡明了環(huán)狀RNA circEXOC6B與RRAGB結(jié)合抑制其異源二聚體的形成，破壞其與RRAGC /D的相互作用，從而阻斷mTORC1通路對(duì)營(yíng)養(yǎng)的感知，抑制HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋環(huán)，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制并增強(qiáng)常用化療藥物5-FU誘導(dǎo)的凋亡。

研究背景

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率第二，死亡率排名第三的惡性腫瘤，常用的放化療治療方法產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重限制了治療效果，探索結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。近年來，越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和化療耐藥性中起著至關(guān)重要的作用。使用高通量RNA測(cè)序，作者先前發(fā)現(xiàn)circEXOC6B在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)。然而，其在結(jié)直腸癌（CRC）中的作用和機(jī)制仍然未知。

研究方法

通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC組織中circEXOC6B的表達(dá),進(jìn)行體內(nèi)和體外功能實(shí)驗(yàn)以確定circEXOC6B對(duì)CRC發(fā)展的抑制作用,通過RNA-pull down、質(zhì)譜、co-IP、熒光原位雜交和免疫熒光，研究circEXOC6B與CRC生長(zhǎng)和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀、雙熒光素酶測(cè)定、Western Blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)用于探討HIF1A調(diào)節(jié)RRAGB轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。

研究結(jié)果

1. circEXOC6B在CRC組織中表達(dá)下調(diào)

作者首先通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定CRC組織中circEXOC6B的表達(dá)，如圖1A所示，與相鄰的非癌組織（正常）相比，在78例CRC組織（癌癥）中，circEXOC6B表達(dá)下調(diào)。為了探索circEXOC6B表達(dá)與CRC患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，再將78例CRC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組（n=?39），根據(jù)circEXOC6B的中值表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明circEXOC6B的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負(fù)相關(guān)（圖1B和表S3）。此外，還檢測(cè)了結(jié)腸癌cDNA芯片中circEXOC6B的表達(dá)，該芯片包含80例癌組織和15例癌旁組織。qRT-PCR結(jié)果顯示，circEXOC6B在癌組織中的表達(dá)也低于匹配的相鄰（正常）組織（圖1C）。Kaplan-Meier生存分析顯示，circEXOC6B高表達(dá)患者的總生存率（OS）（54.8%）高于circEXOC6B低表達(dá)患者總生存率（OS）（20.6%）（P=?0.042）（圖1D）。circEXOC6B表達(dá)較高的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)較低（圖1E）。最后，多元回歸分析進(jìn)一步證實(shí)，高circEXOC6B表達(dá)可將死亡風(fēng)險(xiǎn)降低49.4%（圖1F）。這些結(jié)果表明，circEXOC6B的表達(dá)與與CRC患者總生存期相關(guān)。

2. 體外實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)表明，circEXOC6B可抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)

為了研究circEXOC6B在CRC進(jìn)展中的作用，作者使用特異性靶向circEXOC6B的siRNA敲低了CRC細(xì)胞中circEXOC6B的表達(dá)，并使用circEXOC6B過表達(dá)載體上調(diào)了circEX0C6B的基因表達(dá)（圖2A和S2A）。流式細(xì)胞術(shù)和CCK8、EdU和集落形成實(shí)驗(yàn)表明，敲低circEXOC6B的表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖、克隆形成和細(xì)胞周期，而過表達(dá)circEXOC6B則抑制癌細(xì)胞生存能力和克隆形成（圖2B–D和S2B–E）。此外，流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低circEXOC6B抑制了5-FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)circEXOC6B濃度具有相反的作用（圖2E）。

3. circEXOC6B與RRAGB結(jié)合，干擾其異二聚體的形成

為了探索circEXOC6B調(diào)控CRC進(jìn)展的分子機(jī)制，首先使用FISH、PCR和qRT-PCR檢測(cè)了circEXOC6B在CRC細(xì)胞系和CRC臨床樣本中的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，circEXOC6B主要存在于CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖3A和S4）。細(xì)胞質(zhì)中的circRNAs可以與miRNA或蛋白質(zhì)相互作用，它們與蛋白質(zhì)的結(jié)合被認(rèn)為是它們的主要功能。為了鑒定與circEXOC6B相互作用的蛋白質(zhì)，作者在SW620和HCT116細(xì)胞中進(jìn)行RNA-pull down，隨后，通過質(zhì)譜分析鑒定了17種蛋白質(zhì)。其中，RRAGB是與circEXOC6B結(jié)合的候選蛋白。通過RNA-pull down實(shí)驗(yàn)，再進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了circEXOC6B和RRAGB的結(jié)合（圖3C）。此外，RIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RRAGB可以富集circEXOC6B（圖3D）。為了進(jìn)一步證實(shí)circEXOC6B和RRAGB的相互作用，在CRC細(xì)胞中使用FISH和IF標(biāo)記circEXOC6B和RLAGB。結(jié)果顯示，在CRC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，circEXOC6B和RRAGB共定位。此外，使用catRAPID數(shù)據(jù)庫，預(yù)測(cè)了RRAGB與circEXOC6B的可能結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，RRAGB中circEXOC6B結(jié)合的最可能區(qū)域位于250 aa位點(diǎn)附近（圖S6）。因此，作者構(gòu)建了不同長(zhǎng)度的RRAGB表達(dá)載體（圖3F）。RIP分析顯示，RRAGB的223–346 aa區(qū)域與circEXOC6B的相互作用（圖3G）。有趣的是，該區(qū)域包含RRAGB與RRAGC/D異二聚體的結(jié)合位點(diǎn)（圖3H）。因此，作者推測(cè)，circEXOC6B可能會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地干擾RRAGB–RRAGC/D異二聚體的形成。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，用標(biāo)記RRAGB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞后，對(duì)其進(jìn)行了Co-IP測(cè)定。Western blot結(jié)果顯示，RRAGC和RRAGD與RRAGB的結(jié)合隨著circEXOC6B的過度表達(dá)而降低（圖3I）。這些結(jié)果表明，circEXOC6B可以與RRAGB結(jié)合，并抑制RRAGB和RRAGC/D的異二聚體形成。

4. circEXOC6B抑制mTORC1通路

鑒于激活mTORC1途徑需要RRAGB-RAGC/D異二聚體的形成，我們推斷，circEXOC6B可能通過干擾異二聚物的形成來抑制mTORC1通路。Western blot結(jié)果顯示，circEXOC6B的過表達(dá)降低了p-mTOR、p-S6K和HIF1A的表達(dá)，而其下調(diào)增加了它們的表達(dá)（圖4A和B）。與Western Blot結(jié)果一致，IHC表明皮下腫瘤中p-mTOR和HIF1A表達(dá)也上調(diào)，circEXOC6B表達(dá)穩(wěn)定沉默（圖4C）。此外，作者進(jìn)行了挽救試驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證RRAGB參與mTORC1通路中circEXOC6B的調(diào)節(jié)。WesternBlot實(shí)驗(yàn)顯示，RRAGB引起的p-mTOR、p-S6K和HIF1A升高可以通過與circEXOC6B共轉(zhuǎn)染來逆轉(zhuǎn)（圖4D）。RRAGB誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞的增殖和克隆形成性增強(qiáng)也可以通過circEXOC6B的過度表達(dá)來挽救（圖4E-G）。這些結(jié)果支持以下假設(shè)：circEXOC6B通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RRAGB抑制mTORC1途徑以促進(jìn)CRC生長(zhǎng)。

5. CRC具有HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路，該回路被circEXOC6B拮抗

作者使用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)六種CRC細(xì)胞系中HIF1A和RRAGB的表達(dá)時(shí)，驚奇地發(fā)現(xiàn)HIF1A與RRAGB表達(dá)之間存在正相關(guān)（圖5B）。此外，HIF1A和RRAGB的表達(dá)水平在26個(gè)CRC組織中也呈正相關(guān)（圖5A）。同時(shí)使用GEO（圖S7A）和癌癥基因組圖譜（TCGA）（圖S7B）數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)?/span>CRC中的正相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)促使作者去探索HIF1A和RRAGB表達(dá)之間是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HIF1A的敲低導(dǎo)致RRAGB mRNA表達(dá)的下調(diào)，而RRAGB的過表達(dá)對(duì)HIF1A mRNA表達(dá)沒有影響（圖5C）。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)RRAGB的啟動(dòng)子區(qū)包含三個(gè)HRE（RCGTG），它們是轉(zhuǎn)錄因子HIF1A的結(jié)合位點(diǎn)（圖5C）。隨后的ChIP實(shí)驗(yàn)表明HIF1A與啟動(dòng)子的第二個(gè)HRE位點(diǎn)結(jié)合（圖5D）。隨后，作者構(gòu)建了RRAGBWt和RRAGBMut（突變HRE）熒光素酶報(bào)告基因載體，進(jìn)行雙熒光素素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（圖5E）。結(jié)果表明，敲低HIF1A表達(dá)后，熒光素酶活性降低，但使用HIF1A激活劑ML228過度表達(dá)HIF1A后，熒光素酶活力增加（圖5E）。這些結(jié)果表明HIF1A可以與RRAGB的啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)RRAGB轉(zhuǎn)錄。mTORC1通路促進(jìn)HIF1A的翻譯。因此，HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋環(huán)存在于CRC中，以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而circEXOC6B可能通過與RRAGB結(jié)合來拮抗該環(huán)。作者使用HIF1A激活劑ML228上調(diào)HIF1A，Western Blot結(jié)果顯示RRAGB水平升高。然而，circEXOC6B能夠消除該效應(yīng)并降低RRAGB和HIF1A的表達(dá)（圖5F）。此外，circEXOC6B的過表達(dá)下調(diào)了RRAGB的表達(dá)，而circEXOC6B的敲低則提高了RRAGG的表達(dá)（圖5G和H）。與Western Blot結(jié)果一致，IHC結(jié)果顯示circEXOC6B表達(dá)穩(wěn)定沉默的皮下腫瘤比對(duì)照組具有更高的RRAGB表達(dá)（圖5I）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circEXOC6B在正反饋回路中的抑制作用，使用IHC評(píng)估了22個(gè)CRC臨床樣本中HIF1A、RRAGB和p-mTOR的表達(dá)，包括11例circEXOC6B低表達(dá)和11例circEXOC6B高表達(dá)。結(jié)果表明，HIF1A、RRAGB和p-mTOR水平在高circEXOC6B組中低于低circEXOC6B組（圖S8）。

6.circEXOC6B增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性

5-FU被廣泛用作CRC的一線化療藥物。然而，5-FU的有效性因固有或獲得性化療耐藥性而降低。近年來，mTORC1和HIF1A通路的激活被認(rèn)為是5-FU耐藥的關(guān)鍵原因。之前的流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2E所示，表明circEXOC6B促進(jìn)了5-FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡。此外，發(fā)現(xiàn)5-FU敏感細(xì)胞系RKO、LoVo、HCT116和HT-29中circEXOC6B的表達(dá)高于5-FU非敏感細(xì)胞系SW620（癌癥數(shù)據(jù)庫中藥物敏感性基因組：https://www.cancerrxgene.org/)（圖S9）。因此，circEXOC6B可能通過抑制HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路來增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)5-FU治療的敏感性。為了進(jìn)一步評(píng)估circEXOC6B對(duì)5-FU治療的影響，進(jìn)行TUNEL檢測(cè)5-FU誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，較低的circEXOC6B表達(dá)減少了5-FU誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡，而較高的circEXOC6B的表達(dá)使CRC細(xì)胞對(duì)5-FU治療更敏感（圖6A）。此外，circEXOC6B的敲低降低了凋亡標(biāo)志物裂解caspase-3和裂解PARP的表達(dá)，而其過度表達(dá)增加了其表達(dá)（圖6B）。與凋亡結(jié)果一致，CCK8測(cè)定顯示circEXOC6B的下調(diào)拮抗了5-FU在CRC細(xì)胞增殖中的抑制作用。相反，circEXOC6B的上調(diào)增強(qiáng)了5-FU對(duì)增殖的影響（圖6C）。此外，通過構(gòu)建裸鼠成瘤，以測(cè)試circEXOC6B在體內(nèi)5-FU治療中的作用。腹腔注射5-FU后，sh-circEXOC6B組的腫瘤體積與未治療組無差異。相比之下，5-FU治療后，sh-NC組的腫瘤大小顯著減小（圖6D和E）。此外，在sh-circEXOC6B組中，凋亡標(biāo)志物裂解的caspase-3的表達(dá)沒有增加，但在sh-NC組中顯著升高（圖6F）。與caspase-3的表達(dá)一致，TUNEL結(jié)果顯示，5-FU治療后，sh-circEXOC6B組的凋亡沒有變化，而5-FU處理后，sh-NC組的凋亡顯著增加（圖6G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，circEXOC6B增強(qiáng)了CRC細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。

結(jié)論

本研究揭示了HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋回路的存在，該回路驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌的惡性演進(jìn)， 而circEXOC6B抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)并增加5-FU誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡（附圖）。這些結(jié)果為HIF1A和mTORC1通路之間的串?dāng)_提供了新的見解，并提出了阻斷結(jié)直腸癌進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)，揭示了環(huán)狀RNA調(diào)控結(jié)直腸癌生長(zhǎng)及化療敏感性的新機(jī)制，為尋求結(jié)直腸癌治療新靶點(diǎn)提供了新的技術(shù)途徑。