在電場的作用下將電泳分離的多肽從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測，經(jīng)常用于目的蛋白的表達(dá)特性分析、組織定位、表達(dá)量分析及與其他蛋白的互作。依其原理，可分為兩種方法：A、直接法和B、間接法。

兩種方法比較：

好的蛋白是做出符合要求的目的條帶的前提：

經(jīng)驗(yàn)：我們通常使用BCA法來定量蛋白，提取蛋白質(zhì)過程中，應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以抑制蛋白酶的水解作用，可加入適合的蛋白酶抑制劑。當(dāng)提取磷酸化的蛋白時(shí)一定要加入磷酸化的蛋白酶抑制劑（磷酸化的蛋白極易降解）。蛋白樣品建議分裝后冷凍干燥或直接以液體態(tài)置-80℃中保存，不要反復(fù)凍融。

經(jīng)驗(yàn)：上樣時(shí)根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整蛋白上樣量，盡量保證每孔上樣量保持一致。膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如果需要保存，最好用濕潤的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。

經(jīng)驗(yàn)：膠在負(fù)極，膜靠近正極；濾紙不要大過膜，防止短路；夾好膜和凝膠后，確定在凝膠、膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全；注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜，避免手上的蛋白和油脂降低轉(zhuǎn)膜效率。轉(zhuǎn)膜過程中，尤其是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常 會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。對于濕轉(zhuǎn)法：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為120分鐘。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

經(jīng)驗(yàn)：常見的封閉液有5%脫脂奶粉、BSA和Western Blot膜封閉液（生物試劑公司提供）。但是封閉液的選取具體得看抗體說明書，有的抗體是明確要求只能用BSA，而封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況5%BSA會比5%牛奶的效果好。選擇抗體時(shí)，一方面需要考慮所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一方面需要考慮所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶。

1.出現(xiàn)空白條帶

原因：出現(xiàn)空白條帶的原因比較多，如一抗?jié)舛冗^低，二抗種屬加錯(cuò)（兔抗加成鼠抗），轉(zhuǎn)膜時(shí)間過長、過短都會出現(xiàn)空白條帶。

解決方法：仔細(xì)檢查抗體是否加錯(cuò)，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜時(shí)間沒有問題。

經(jīng)驗(yàn)：如果條帶上沒有一點(diǎn)信號，大部分情況是抗體加錯(cuò)了。如果出現(xiàn)細(xì)微條帶，可能是因?yàn)樯蠘恿刻伲鞍琢刻汀；蚴且豢節(jié)舛鹊停l(fā)光液失效。當(dāng)然如果轉(zhuǎn)膜時(shí)膜放反了的話那肯定是不會出現(xiàn)條帶。所以實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要細(xì)致認(rèn)真。

2.高背景

原因：封閉不夠好，一抗?jié)舛冗^高，洗膜時(shí)間和次數(shù)不夠。

解決方法：降低一抗?jié)舛龋黾酉茨r(shí)間和次數(shù)。

經(jīng)驗(yàn)：高倍鏡可能是WB中最長出現(xiàn)的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方有彌漫性較為均一的背景。洗膜時(shí)間按照5min*5次或者10min*3次。如果洗膜時(shí)間沒有偷工減料的話，調(diào)整一抗?jié)舛染蜁玫礁蓛羟逦臈l帶了。

3.非特異性條帶

原因：一抗非特異性與蛋白結(jié)合，一抗?jié)舛冗^高。

解決辦法：更換一抗。

經(jīng)驗(yàn)：這種情況絕大多數(shù)原因是因?yàn)橐豢共缓谩３霈F(xiàn)這種情況就無法判斷你需要的目的條帶是哪一條。如果沒有條件更換更好的抗體建議試用陰性對照和陽性對照來判定那一條是你需要的目的條帶。還有很小可能是因?yàn)橐豢節(jié)舛冗^高引起的非特異性結(jié)合。

4.條帶中出現(xiàn)白圈

原因：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜和膠之前存在氣泡。

解決辦法：轉(zhuǎn)膜前趕除膜與膠之間的氣泡。

經(jīng)驗(yàn)：我們常常將電轉(zhuǎn)液倒入一個(gè)盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平，然后往濾紙上澆點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液，把電泳膠用清水清洗下，將電泳膠平鋪到濾紙上，仔細(xì)檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前后觀察，不同方向觀察之后確認(rèn)無氣泡，然后再往膠上面澆點(diǎn)電轉(zhuǎn)液，用兩只手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側(cè)中間，使膜成U型，然后將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然后上層濾紙同樣用U型的放置方法，用切膠板壓住一邊另一塊切膠板從內(nèi)向外趕氣泡，然后蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。

5.某個(gè)條帶變形

原因：SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒。 

解決辦法：配膠過程中要小心，使用無雜質(zhì)的液體。

經(jīng)驗(yàn)：很多實(shí)驗(yàn)室中使用的不是最新的設(shè)備，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年之后，會從下面往上面漏小氣泡，當(dāng)氣泡足夠小并且膠快凝固的時(shí)候，走到中間的小氣泡就停留在膠內(nèi)，并會影響到后面的跑膠。另外配膠用的水，SDS，Tris緩沖液要注意不要有雜質(zhì)。

6.最邊緣條帶彎曲

原因：電泳電流不均一。

解決辦法：換用新的電泳槽； 不使用兩邊的兩孔。 

經(jīng)驗(yàn)：一般我們使用的是10孔的的膠，如果你上樣剛好10個(gè)孔，那么最兩頭的兩個(gè)孔肯定會歪曲。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場均一。

7.其他問題

（1）整個(gè)條帶呈 “ ︶ ” 狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化；

（2）整個(gè)條帶呈“ ︵ ”： 凝膠左右兩頭沒有凝固好；

（3）溴酚藍(lán)拖尾：樣品溶解不好；

（4）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒；

（5）溴酚藍(lán)很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短，或者是濃縮膠配錯(cuò)；

（6）在分離膠中跑不動：Tris-Cl PH值不對，或者忘記加SDS。