一、胚胎移植的概念

1、胚胎移植(embryo transfer，ET)

指將一只雌性動物的早期胚胎(或受精卵)取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎(或受精卵)，移植到另一只同種生理狀態相同的雌性動物的體內，使之繼續發育成為新個體的技術，又稱之為“人工受胎” 或“借腹懷胎”。其中提供胚胎的個體稱為供體(donor)，接受胚胎的個體稱為受體(recipient)。

2、胚胎移植程序

（1）供、受體的同步發情；

（2）供體的超數排卵和配種；

（3）胚胎的采集；

（4）胚胎的質量鑒定；

（5）胚胎的移植；

二、供體及受體的同步發情方法

同步發情 (estrus synchronization)是使供、受體動物在同一時期內同時發情、同期排卵的技術，是胚胎移植的前提，供、受體只有發情同期化，其生殖道的內環境才能一致，才能使移植的異體動物的胚胎著床。

同步發情的原理是通過外源激素的調節，控制供、受體的動物的發情排卵在同一時間發生。其策略有二：1是使黃體期縮短，2是使黃體期延長。

圖注：A:自然發情周期；B:縮短黃體期(前列腺素F2a處理法) ；C:延長黃體期(孕激素處理法)

三、供、載體的超數排卵和配種法

在動物發情周期的適當時間，注射外源促性腺激素，使卵巢比自然發情時有更多的卵泡發育并排卵，這種方法稱為超數排卵(superovulation)， 簡稱超排。動物卵巢上約有99%的有腔卵泡發生閉鎖而退化，只有1%能發育成熟而排卵。

實驗研究發現在動物的黃體期結束之后，卵泡期啟動之前，注射促性腺激素，能使卵泡不發生閉鎖而正常發育，在排卵之前再注射黃體生成素(LH)或人絨毛膜促性腺激素(HCG) 補充內源性的黃體生成素(LH)不足，可保證多數卵泡成熟、排卵。

對動物做超數排卵處理的常用激素有：孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH) 等。

1、經過超數排卵處理的動物發情后應適時配種；

2、由于超排時的生殖道環境與自然發情差異較大，為保證排出的卵子能及時受精，應使用活率高、密度大的精液，而且輸精次數和每次輸精的有效精子數至少要增加1倍。

圖注：A（左）、B（右）：不同活率及密度的精液對比

供體：正常母鼠腹腔注射50μLPMSG，相隔48h后，再腹腔注射等量HGG，當日與正常雄鼠1:1合籠交配，次日檢栓(陰道涂片觀察)，見栓當日為妊娠第1日。

制備假孕母鼠：首先要獲得結扎公鼠。將 6～8 周齡的公鼠，麻醉，腹部手術，將兩側的輸管結扎，縫合，休息 4 周以上備用。在供體小鼠合籠后的12-24h內，將準備作受體的雌性小鼠與扎公鼠合籠(1:1)。第二天清晨檢查陰栓，有陰道栓者為假孕母鼠。

圖注：A：公鼠與母鼠合籠；B：陰道栓觀察

四、胚胎的采集

胚胎采集又稱沖卵、采胚，它是利用特定的溶液和裝置將早期胚胎從母體的子宮或輸卵管中沖出并回收利用的過程。胚胎的沖洗采用腹部切開的手術法。要根據實驗的需求從不同的部位沖取不同發育階段的胚胎。沖洗時要考慮配種時間、排卵時間、胚胎位置，才能得到較高的收集率。

圖注：輸卵管采胚法：一般是用帶有磨鈍針頭的注射器刺入子宮角頂端，注入沖胚液，然后從輸卵管的傘部接取沖胚液(上行法，圖A（左）)，也可與之相反方向沖取(下行法，圖B（右）)

圖注：子宮角采胚法 ：按上圖的方法對子宮角進行上行或下行法沖洗，采集胚胎。

五、胚胎的質量鑒定

胚胎的鑒定是指應用各種手段對胚胎質量和活力進行評定或等級分類。生產中常用形態學方法進行胚胎的級別鑒定，就是將體視鏡的放大倍數調至 80～100倍，通過觀察胚胎的形態、卵裂球大小與均勻度、色澤、細胞密度、與透明帶間隙以及細胞變性等情況，將胚胎進行質量分級。

在國內，胚胎按質量的高低被分為 A、 B、 C和D四級，與國際上的1、2、3和4級相應，具體標準見下表。正常發育的胚胎，其中卵裂球一般外形整齊清晰，大小一致，分布勻而緊密，發育速度與胚胎日齡相一致。對發育正常的胚胎供移植或體外培養和保存。胚胎質量和活力鑒定除了形態學方法外，還有體外培養法、熒光法(活體染色法)、測定代謝活性和胚胎的細胞計數。

圖注：不同發育階段的早期胚胎以及異常卵的形態

六、胚胎移植

1、移入路徑

（1）不加培養的胚胎：

從輸卵管沖出的胚胎應移入受體的輸卵管內；

從子宮角沖出的胚胎應移入受體的子宮角內。

（2）經過培養的胚胎：

體外生產的胚胎，則要根據胚胎發育的階段，移入相應的部位。

2、數量

（1）單胎動物：

移入1～2枚合格的胚胎即可；

（2）多胎動物：

至少要移入4 枚以上的胚胎，才能產生足夠的妊娠信號，使胚胎著床(實驗動物一般為多胎動物)

3、手法

各種動物的生理特點不同，胚胎移植的操作也有差異。

圖注：手術法將胚胎移入輸卵管

圖注：手術法將胚胎移入子宮角

七、實驗步驟

1、實驗鼠適應性飼養1周。術前禁食12 h(不禁水)。將實驗鼠放進連接好的麻醉機誘導箱，調整異氟烷濃度至5%，完成誘導麻醉后將實驗鼠仰臥位固定在手術板上；

2、調整異氟烷濃度至2%，連接面罩并持續吸入。手術期間氣體麻醉維持。實驗鼠經喉氣管插管與小動物呼吸機連接，調整呼吸機呼吸頻率、呼吸比與潮氣量；

3、術前、術后注意維持實驗動物體溫(恒溫墊控制溫度37 ℃)；

4、子宮內移植的手術難度較小，但只適用于從桑椹胚到囊胚期階段的胚胎。方法是選見陰栓第2.5天或第3.5天的懷孕或假孕雌鼠。背位開一口，在子宮角靠輸卵管部位選血管分布少的部位，用4號針扎一小孔，然后用玻璃微管把桑椹胚或囊胚期的胚胎移入。無論何部位的移植?都應盡量避免帶入多余的培養液或氣泡；

5、每次移入操作后應將移植管尖端浸入培養液中在解剖鏡下檢查移植管中有無余留胚胎。若有應再次補移。為確定移入胚胎的分布可在移入后的第 10 天或18.5天打開腹腔檢查移植胚胎的植入或分布以及胎兒成活情況。

八、實驗成果展示

實驗數據分析

總結：相同品系的balb/c鼠的胚胎移植成功率最高，balb/c 鼠與C57鼠的胚胎移植率最低，其中其他基因型鼠的胚胎移植率高可能受到遺傳特性的影響

九、實驗總結

1、胚胎存放時間：胚胎沖出后，應立即檢出和進行胚胎形態鑒定，胚胎在體外或室溫下存放時間越短越好；

2、移植針標準：移植針在酒精燈上徒手拉制要求一定要細，不合格的不能用，這樣才能在虹吸時不帶走多余的液體，以確保胚胎著床率；

3、子宮角定位：在針刺子宮角時，對子宮角的不當固定或過度牽拉，將導致子宮的損傷、瘀血等，影響小鼠受孕；

4、受體的準備：在胚胎移植中，胚胎最終必須移植到合適的受體中才能妊娠，因為受體的生殖、生理狀態對妊娠率有很大的影響，因此受體的準備非常重要，要經過嚴格的篩選，受體的選擇要求營養狀態和性周期正常，移植時卵巢有紅體存在。胚胎檢出后，應立即對受體實施麻醉及移植手術，應盡快在短時間內將胚胎移入受體子宮內；

5、無菌操作：在整個手術過程中，一定要注意保持無菌，無論是對供、受體的污染，還是對胚胎的污染，在一定程度上都會對胚胎和妊娠環境有不良刺激，降低胚胎質量和移植妊娠率，從而影響胚胎移植質量；

6、胚胎保存：在撿、洗胚胎的PBS液中，一定要加入適量的新生牛血清，以防止胚胎下沉后與表面皿底部貼壁，撿、洗胚胎完成后，應將其放入37度恒溫箱內，同時，還要防止表面皿中液體過少而蒸發干，在體視顯微鏡下進行撿胚時，速度盡量快，防止因為體視顯微鏡的燈光很熱及長時間的燒烤導致胚胎死亡；

7、移植操作技術：手術中，在往子宮角吹入胚胎時，推壓注射器活塞的速度一定要慢，力度要把握適當，以防將空氣注入子宮內而影響到移入胚胎在受體鼠子宮內的著床。操作水平的高低會直接影響移植妊娠率，主要包括對胚胎和受體的移植部位的不同技術的操作，熟練的操作者手法輕柔迅速，可以大大縮短操作時間，減少對子宮和胚胎的損傷；

8、調整移植針尖：手術中，如果早注入胚胎時，移植針內的液體不下行，是因為針尖與子宮貼壁造成的，此時科適當將移植針的針尖從子宮角內提起一些，再慢慢推注；

9、移植的胚胎數量：移植的胚胎數量不能太多，如單側移植每次不能超過10枚，雙側移植不能超過25枚，移植太多對受體不好，甚至導致受體死亡

10、供受體發情同步：供體小鼠的發情與受體小鼠發情的同步性密切相關，是決定胚胎能否移植成功的關鍵，故受體鼠與結扎公鼠的合籠時間與供體鼠的見栓時間晚12-24小時，同步見栓者，移植效果不佳

11、麻醉：在進行胚胎移植手術時，小鼠的麻醉程度不要太深，手術結束后，8h內要禁食禁水。