一、取材

動物麻醉后，解剖迅速取出所需的新鮮組織，立刻轉到固定液中固定，此步應盡可能快速完成，防止組織暴露在外因此后續檢測結果。

二、脫水

固定好的組織，轉到15%蔗糖中脫水至沉底，再轉到30%蔗糖中沉底即可。注意：所用的固定液和脫水劑均是用PBS緩沖液來配制，如果不是，會破壞細胞膜的結構。

三、速凍

1、將組織塊平放于冰凍切片塑料模具內，緩緩加入包埋劑OCT到模具內，避免引起氣泡。注意：需要切片的位置放到模具底部。

另外值得注意的是：一般在進行速凍之前，先用包埋劑浸沒組織1-2h，然后再進行速凍。

2、用夾子夾住包埋好的組織放到液氮中，此時開始氣化沸騰。注意：包埋模具切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

注：要防止冰晶的產生，就是要控制組織的速凍過程，水的物理性質可知，水在-4度的時候，體積最大，這就說明了，如果水在-4度的停留時間越長，組織體內的冰晶體積就越大，數量就越多。因此，我們要做好冰凍切片，防止組織出現空泡，就是要在速凍過程中，減少水停留在-4的的時間。

3、制成凍塊后，即可置入恒冷凍切片機進行切片。備注：若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。

4、托臺上涂一層OCT包埋膠，將速凍好的組織置于涂好OCT的托臺上，放上鐵壓臺，利用重力壓平組織。

四、切片

1、把冷凍好的組織承載器裝到儀器的進退鍵上，手工旋轉旋鈕，觀察是否固定好。

2、調好切片厚度，修片，修到需要的位置再切，恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，切片機置于低溫密閉室內，切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至5-20μm，一般切10um既可。

3、切片時，低溫室內溫度以-15℃ ~ -22℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

注意：包埋劑的選擇，包埋劑是對冰凍切片的質粒是一個重要的影響因素，常規的包埋劑有OCT劑，B超耦合劑和普通的膠水；其中B超耦合劑適用于細胞豐富質地較嫩的組織，普通膠水和OCT劑適用于纖維豐富質地偏硬的組織。

五、冰凍切片的注意事項
       (1) 速凍：是冰凍切片的關鍵，因為只有速凍才能減少組織內的冰晶，最好的辦法是將速凍頭壓在組織上，凍好后就可切片。特別適用于較脆的組織。而含有脂肪較多的組織，最放放在液氮里處理。在液氮里冷凍要注意不要凍過頭，2～3秒鐘就要拿出來看一下，只要有4/5的組織已經凍住就可以了，待冷凍頭拿出后剛好全部凍住，否則就會引起組織發脆，或冷凍頭與組織分離 [醫學教育網整理發布]。
        (2)固定：切片后應立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成細胞退變。一般來說甲醇作用快，收縮小，染色較清晰，是冰凍切片最理想的固定液。

注意: 此步是針對新鮮組織冰凍切片的固定方法。
       (3)包埋劑：一般用OCT包埋劑即可，也可用普通膠水代替，但要加入適量的水（膠水與水的比例大約在2：1左右）。太稀容易損傷切片刀；太稠會粘在切片上不容易洗掉,影響切片的質量。
        (4)冰凍用切片刀每次要用新的刀片，刀片的質量是影響冰凍切片的關鍵。

        (5)如果組織發脆，一般是冷凍過久則可等幾分鐘后再切，也可用手在組織上稍稍加溫。
       (6)冷凍室的溫度冬天一般設在-19℃左右，夏天設在-22℃左右。不同的組織,有不同的溫度要求:肝臟、甲狀腺組織溫度控制在-15℃左右，脂肪組織一般在-35℃以下。
       (7) 冷凍切片機應長期處于恒溫冷凍狀態，經常的開關機器電源容易造成壓縮機損傷。

表1 石蠟切片與冰凍切片的優缺點比較


表2 不同溫度下各新鮮組織冷凍頭和冷凍箱的溫度

一般方法做的冰凍切片有如下的空泡（冰晶形成的結果）

結果展示