腦膠質瘤呈浸潤性生長，邊界不清，惡性程度高，手術不能完全切除，且由于血腦屏障的存在導致化療效果不佳，同時對放療不敏感，故患者多數(shù)預后較差，5年生存率不超過5%，術后復發(fā)率較高，患者平均生存時間僅一年左右。為研究腦膠質瘤的發(fā)病機制，必須建立一種穩(wěn)定、良好的腦膠質瘤動物模型。

目前建立腦膠質瘤動物模型的方法主要有誘發(fā)型、移植型和轉基因型三類：(1)誘發(fā)型：包括化學物質誘發(fā)和病毒誘發(fā)，此類動物模型的生物學特征不穩(wěn)定，且針對某些特殊病毒性腫瘤會表現(xiàn)出很強的免疫原性，故實際應用存在局限性；(2)轉基因型：此類動物模型的生物學特征不穩(wěn)定，來源有限，且實驗成本高；(3) 移植型：移植瘤株存活性高且易于保存，動物模型易建立，生物學特性與人腦膠質瘤最為接近，實驗成本低廉，是目前建立最多、研究最廣泛的膠質瘤模型。

一、移植型腦膠質瘤模型

建立移植型的腦膠質瘤模型通常選用C6腦膠質瘤細胞，該細胞：(1)同時具備膠質瘤細胞和惡性細胞生物特性；(2)組織相容性強，與各種大鼠均能配適；(3)在大鼠腦內接種后腫瘤形成時間短，成活率較高，生存期較穩(wěn)定; (4)生物學特性與人腦膠質瘤較為接近，有浸潤性生長、新生血管形成的特性，建立模型的瘤體特征及生長方式更接近于人腦惡性膠質，呈現(xiàn)多形性、高有絲分裂指數(shù)、瘤內局灶壞死出血、腦實質浸潤、腫瘤血管豐富且無包膜的特點，適合用來研究腦膠質瘤的發(fā)病機制和治療方法。

細胞培養(yǎng)：

取C6腦膠質瘤細胞2×10?個，置于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U /mL青霉素和100 μg /mL鏈霉素)進行傳代連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h，細胞融合80%-90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化。倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮變圓，且有個別細胞脫落時加入完全培養(yǎng)基終止消化。臺盼藍排斥試驗檢測細胞活力，C6存活率應＞90%

注意：若細胞活性差，則需再次培養(yǎng)，直至檢測活性符合造模需要為止。1000 r /min離心3-4 min，收集細胞，用無血清培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，采用血球計數(shù)板計數(shù)，將單細胞懸液密度調整為1 × 10?個/10 μL，置于37 ℃恒溫振蕩水浴中存放待用(目的：避免由于細胞死亡和沉底造成細胞密度不均勻)，盡量在短時間內(注意：不超過90 min) 接種。

二、腦膠質瘤模型造模方法

動物品系：SPF級SD大鼠，健康，6~8W，雄性，體重為180g-200g；

實驗分組：正常對照組、模型組；

實驗周期：4-6 weeks；

實驗應用：用于研究腦膠質瘤引起的腦部損傷；

造模方法 

(1)大鼠稱重后以1.25％阿佛丁（三溴乙醇）按10ml/kg體重腹腔麻醉，麻醉成功后剃除顱頂部毛發(fā)，取俯臥位，將動物頭部固定于腦立體定位儀上，保持顱頂水平位置；

圖注：拓普生物腦立體定位儀

(2)手術區(qū)常規(guī)消毒，沿顱頂正中矢狀線縱向切開長約2cm皮膚，分離暴露顱骨；

(3)鈍性分離肌肉及骨膜，雙氧水消毒及止血，在距前囪正中線前6mm、中線旁開2~3cm處，用5mL注射器針頭鉆孔,不可傷及硬腦膜；

(4-1)30 μL微量注射器抽吸25μL單細胞懸液，針尖調節(jié)至觸及硬腦膜，沿骨孔緩慢垂直進針至硬腦膜下5.5 mm，退針1 mm后固定(目的：創(chuàng)建一個細胞懸液暫時存儲空間，并防止其沿針道擴散)；

(4-2)緩慢將細胞懸液注入尾狀核內(注意：如果太快會引起細胞懸浮液從腦內溢出，沿腦脊液播散，導致種植細胞數(shù)減少，腫瘤難以成長為實體瘤，或細胞在頭皮下生長，造模失敗)，注射時間為10 min(1 μL /min)，注射完畢后留針5 -10min(目的：留針可防止腫瘤細胞溢出，有利于瘤細胞沉積在穿刺道的底部，減少因虹吸效應導致細胞沿注射針回流出腦外，并延長腫瘤細胞與靶點腦組織的接觸時間，從而提高成瘤率；同時有利于腦組織適應局部的壓力增高，減少瘤細胞沿針道種植轉移)，緩慢拔針(目的：防止接種細胞的反流)，骨孔用骨蠟密封住；

(5)逐層縫合皮膚，生理鹽水沖洗術野，噴灑適量抗生素，縫合皮膚，切口消毒，放入保暖箱內。大鼠麻醉蘇醒后放回飼養(yǎng)箱飼養(yǎng)并觀察。

三、術后檢測

1、一般情況：

（1）正常組生長狀況良好，活動、飲食均正常；

（2）模型組接種后隨著時間延長，前期大鼠進食逐漸減少，體重逐漸下降，眼周有出血癥狀，中期甚或出現(xiàn)眼周瘀血，精神逐漸萎靡、反應遲鈍、腹瀉，后期上述癥狀明顯加重，皮毛失去光澤，部分出現(xiàn)偏癱、昏迷，甚至死亡。

2、全腦標本觀察：

可在腫瘤細胞種植后至實驗結束前分時間點獲取全腦標本，以測量膠質瘤大體標本的體積，按腦表面的接種穿刺點作一冠狀交叉切口，觀察腫瘤生長情況并計算腫瘤體積= a×b×c(a為腫瘤的最大徑，b為與最大徑垂直的最寬徑，c為腫瘤的高) ；

模型組大腦左側腫瘤浸潤性生長，較周圍正常組織顏色深，腦中線向右偏，占位效應明顯，切面可見腫瘤內出血和組織壞死。隨著建模時間的延長，腫瘤的體積會不斷增加。

 圖注：正常組腦中線居中（左）與模型組占位引起腦中線偏移（右）

3、HE染色(蘇木精-伊紅染色)：

模型組腦組織HE染色后可見腫瘤細胞呈橢圓形，核大深染，核分裂相多見，圍繞血管生長活躍，排列紊亂，腫瘤組織內有出血和壞死區(qū)域，伴有豐富的膨脹的微血管，微血管內充斥著大量的紅細胞，并被壞死區(qū)域包圍。

圖注：C6腦膠質瘤傾向圍繞血管生長

 圖注：C6腦膠質瘤接種后7天、14天、21天

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