編者按

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今天跟大家分享一篇2018年12月發表在Diabetes上的動物模型構建+測序+實驗驗證的文章,題目為miRNA Regulation of the Hyperproliferative Phenotype of Vascular Smooth Muscle Cells in Diabetes。本文章通過構建1型糖尿?。═1DM）和2型糖尿病（T2DM）的大鼠動脈球囊損傷模型進行RNA 測序，生物信息學分析鑒定出6種可能引起糖尿病血管性疾病的miRNAs，分子實驗和臨床標本驗證最終篩選出了低表達的miR-29c和高表達的miR-204參與了糖尿病血管性疾病，并通過進一步的生物信息學分析和細胞、動物實驗證明了在糖尿病疾病動物及細胞模型中，激活 miR-29c（靶向Emp2） 和抑制 miR-204（靶向Cav1)可防止動脈損傷后血管平滑肌細胞 (VSMC)過度增殖。

圖注：文章流程圖

文章結果展示：

1、作者構建了1型糖尿病和2型糖尿病的大鼠動脈球囊損傷模型，通過BrdU染色和H&E染色證明了兩種糖尿病都可以加重中層 VSMC 的增殖反應，增加了血管損傷部位的動脈狹窄。

2、通過對上述模型的損傷血管組織進行RNA-seq及生物信息學分析，作者發現miR-195、miR-29c、miR-140和 miR-199a-5p 在 T1DM 和 T2DM動物模型中均下調，同時，miR-25 和 miR-204 在兩種 DM 類型中均特異性上調。這六種 microRNA可能參與調節 DM 中 VSMC 的增殖反應。

3、在上述失調的6種miRNA 中，作者對它們在體外的功能進行了初步評估并利用臨床上的人血管組織中繪制了表達譜，最終發現miR-29c 和 miR-204具有最高特異性調節糖尿病依賴性 VSMC 增殖表型的潛力。

4、接著作者利用高葡萄糖 (HG) 、胰島素 (HI)以及血小板衍生因子(PDGF-BB)構建VSMC細胞模型，對miR-29c 和 miR-204進行敲低和過表達，通過EdU染色和細胞周期檢測，進一步證明了miR-29c 和 miR-204在VSMC 增殖中的作用。

5、隨后，作者對測序數據中的mRNA進行生物信息學分析，并對miR-29c 和 miR-204的靶標基因進行分析，結果表明與 VSMC 表型增殖相關的幾種通路在兩種 DM 模型中都被激活，兩種 DM 模型中失調的 miRNA-mRNA 靶標富集細胞周期、細胞死亡、及遷移相關的分子通路。

6、為了進一步確定miR-29c 和 miR-204的靶標基因，作者進行了Ago 蛋白-RNA 免疫沉淀測定 (RIP)和熒光素酶報告基因實驗，并利用上述構建的細胞模型進行功能驗證，結果表明miR-29c 直接抑制 Emp2，這是調節 miR-29c 調節 VSMC 增殖的主要靶標，另一方面，miR-204 可以微調 CAV1 蛋白的表達，該調節將 miR-204 和 miR-29c 活性聯系起來，都在激活 VSMC 增殖的分子網絡中靶向 Cav1。

7、最后，作者利用腺病毒（Adeno-Combo-miR-29c-m/miR204-i）給藥方式進行了體內實驗，再通過FISH等實驗驗證，最終證明miR-29c 和 miR-204與它們的靶標 EMP2 和 CAV1 形成分子網絡調控，在調節糖尿病中VSMC 增殖中起到關鍵作用。

總結

該文章通過高通量組學和適量的相關實驗證明了通過過表達miR-29c和靶向抑制miR-204可顯著減少糖尿病動脈狹窄，為臨床糖尿病血管疾病的治療提供了非常好的靶標和治療思路。

Diabetes是中科院醫學1區Top期刊，在內分泌領域有著非常高的權威，該文雖發表于2018年，但其套路非常經典，一直沿用至今，如2021年9月發表于Molecular Medicine（中科院2區雜志）的一篇名為MicroRNA regulation of the proliferation and apoptosis of Leydig cells in diabetes的文章，基本是在該框架下設計的文章，值得大家學習品鑒。

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