干眼癥(dryeyesyndrome，xeorphhtalmia)又名結(jié)膜干燥綜合征，是一種受眼部和/或全身多種因素(如眼表功能障礙、眼部外傷、糖尿病、炎癥等)影響出現(xiàn)淚腺低分泌而導(dǎo)致淚膜異常、眼表上皮干變的常見眼科疾病。干眼癥患者的臨床初始表現(xiàn)包括異物感、干澀感、發(fā)癢、燒灼感、畏光、視物模糊、易視疲勞、難以名狀的不適及不能耐受有煙塵的環(huán)境等 。這些癥狀隨病情進(jìn)展而加重，最終出現(xiàn)角膜潰瘍甚至失明。目前臨床主要通過外科手術(shù)或藥物治療來恢復(fù)淚液和黏液的分泌，改善角膜組織病變，但都不能治愈。建立合適的干眼動物模型對藥物作用機制的探討、藥物療效的評價以及干眼病因病機的研究都具有重大的意義。

淚液由淚腺分泌，其中95%以上由主淚腺分泌，少部分淚液來自副淚腺。淚液在眼表面形成淚膜。淚膜由外向內(nèi)依次分為脂質(zhì)層、水質(zhì)層和黏液層，脂質(zhì)層由瞼板腺、Zeiss腺、Moll腺所分泌。水質(zhì)層由主、副淚腺所分泌。黏液層主要由結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞分泌，部分由主淚腺分泌。淚液的總量、構(gòu)成、分布和淚膜間隙改變都能導(dǎo)致干眼的發(fā)生。其中淚液滲透壓的升高和淚膜不穩(wěn)定是干眼癥發(fā)生的兩大核心機制，任何引起淚液滲透壓升高或淚膜不穩(wěn)定的因素都可導(dǎo)致干眼癥的發(fā)生，且兩者互為因果。大鼠的主淚腺分為眶內(nèi)淚腺和眶外淚腺，眶內(nèi)淚腺是哈德腺(Harderian gland)，眶外淚腺是漿液腺。

一、干眼癥模型分類

按發(fā)病機制：按發(fā)病機制：可以分為淚液缺乏型和淚液蒸發(fā)過強型。

1、淚液缺乏型干眼癥：先天性淚腺缺乏、老年性淚腺功能降低、自身免疫性疾病、淚腺外傷、感染和自律神經(jīng)失調(diào)、長期使用某種眼藥水、服用某些藥物，或是長期戴隱形眼鏡都會導(dǎo)致淚液不足型干眼癥。

2、蒸發(fā)過強型干眼癥：淚膜的脂質(zhì)層能夠防止水樣淚液與空氣接觸而減少淚液蒸發(fā)，而脂質(zhì)層主要來源于瞼板腺。瞼板腺功能障礙會導(dǎo)致淚膜結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性下降，引起蒸發(fā)過強型干眼癥。

按照造模手段可以分為四大類：藥物造模、手術(shù)造模、內(nèi)源性物質(zhì)缺乏和淚環(huán)境誘導(dǎo)。

二、藥物誘導(dǎo)型

1、 膽堿能受體拮抗劑誘導(dǎo)

原理：副交感神經(jīng)興奮能增加淚液分泌，膽堿能受體阻斷劑東莨菪堿是一種外周抗膽堿藥物，能通過抑制副交感神經(jīng)興奮，競爭性抑制淚腺M受體，顯著降低淚液分泌進(jìn)而導(dǎo)致干眼癥癥狀。

方法：在實驗鼠皮下注射氫溴酸東莨菪堿注射液(3次/天)，后將動物安置在雙面網(wǎng)格籠子里，復(fù)合風(fēng)扇模擬干燥環(huán)境(濕度控制在35%-40%)，每個周期為5-10天。

特點：可建立淚液分泌不足合并蒸發(fā)過強型干眼模型。該造模方法可引起淚液分泌量顯著減少、結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)目減少、角膜熒光染色增加等干眼體征。東莨菪堿對眼表損傷程度較輕，對大鼠淚腺及眼表上皮細(xì)胞無明顯影響，可用于制備早期輕、中度干眼癥模型。

2、苯扎氯銨誘發(fā)干眼癥模型   

原理：苯扎氯銨是一種季銨陽離子，作為防腐劑廣泛用于保存眼科制劑，其可破壞角膜上皮細(xì)胞層的淺表面細(xì)胞間的緊密連接，從而損傷角膜上皮細(xì)胞層的功能，使用含有苯扎氯銨的局部滴眼劑會使干眼癥惡化。

方法：以0.2%的苯扎氯銨對實驗鼠進(jìn)行點眼(每眼5μL/次，3次/天)，連續(xù)7天。

特點：可建立嚴(yán)重型蒸發(fā)過強型干眼癥。該造模方法可引起淚膜穩(wěn)定性受損、眼表炎癥、角膜上皮細(xì)胞凋亡與杯狀細(xì)胞丟失、鱗狀上皮化生等，其臨床表現(xiàn)和相關(guān)組織病理改變均類似于人干眼癥。

3、淚液高滲透壓性干眼癥模型 

原理：淚液的高滲透壓是干眼上皮損傷的關(guān)鍵因素之一，還可直接誘發(fā)眼表的炎癥反應(yīng)。正常人的淚液滲透壓是(302. 0 ± 9. 7) mOsmol /L，干眼癥患者淚液的滲透壓是(326. 9 ±22. 1) mOsmol /L。用>316 mOsmol /L作為干眼診斷的診斷指標(biāo)，其總體準(zhǔn)確度優(yōu)于其他任何一項干眼診斷指標(biāo)。研究表明，小鼠眼表滲透壓達(dá)到500 mOsmol /L可以導(dǎo)致眼表炎癥反應(yīng)。

方法：實驗鼠以500 mOsm·L^-1 氯化鈉溶液點眼(5次/天)， 持續(xù) 42天。

特點：造模7天后，實驗鼠角膜熒光素鈉染色評分增加，角膜和結(jié)膜出現(xiàn)與干眼癥患者類似的體征和組織病理學(xué)變化。

優(yōu)點：簡單可靠，重復(fù)性好。

三、手術(shù)造模型

1、暴露性干眼癥模型 

原理：通過手術(shù)減少動物瞬目頻率，使淚液蒸發(fā)過多，淚液中黏蛋白缺乏，眼表組織繼而干燥失活，角膜上皮細(xì)胞壞死缺損，從而引起角膜上皮屏障功能損害而出現(xiàn)干眼癥狀。

方法：將實驗鼠麻醉后固定，消毒眼周皮膚，用手術(shù)線褥式縫合上下眼瞼并分別固定于眶周相應(yīng)皮膚上，造模環(huán)境應(yīng)控制溫度在(20-23)℃，相對濕度在(40±10)%。

特點：可建立蒸發(fā)過強型干眼模型，淚膜破裂時間縮短、角膜熒光染色增強、淚流量明顯減少等，符合干眼癥的臨床癥狀。

2、淚液缺乏型干眼癥模型 

原理：摘除淚腺制成干眼模型。

方法：將實驗鼠麻醉后固定，于耳下方約1 cm處沿皮紋做橫行切口1 cm，暴露皮下微黃色圓形腺體(眶外淚腺)，分離周邊包膜將其完整摘除，生理鹽水沖洗，縫合切口；于眼外側(cè)1 cm 處做縱行切口1 cm，暴露皮下白色質(zhì)硬膜，切開見一三角形腺體(眶內(nèi)淚腺)，將其完整摘除，生理鹽水沖洗，縫合切口。

特點：術(shù)后2周后開始出現(xiàn)干眼癥狀，第4周癥狀顯著。如果僅去除大鼠眶外淚腺可以導(dǎo)致淚液量減少 50% 和角膜熒光染色的逐漸增加。

四、內(nèi)源物質(zhì)缺乏型

維生素A缺乏干眼癥模型 

原理：維生素A中含有視黃酸、視黃醛、視黃醇等活性衍生物，可以維持正常視力和免疫系統(tǒng)。維生素A缺乏可導(dǎo)致上皮細(xì)胞過度角化、淚腺分泌減少、角膜上皮及結(jié)膜干燥而引起干眼癥。

方法：以干酪素為主的維生素A完全缺乏飼料喂養(yǎng)。

特點：6個月后，可見淚腺萎縮、結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少、角膜上皮角化，致使淚液分泌的質(zhì)與量改變，眼表上皮干燥失活，淚膜穩(wěn)定性降低等干眼癥癥狀 。

五、淚液動力學(xué)異常型干眼癥

1、環(huán)境誘導(dǎo)型干眼模型 

原理：干眼癥的發(fā)病率和環(huán)境有著密切的關(guān)系。長期于空調(diào)房、密閉機艙、電腦房等環(huán)境的工作人群誘發(fā)干眼癥的概率明顯增加。為建立環(huán)境誘發(fā)干眼模型，可運用全智能化系統(tǒng)，對室內(nèi)溫度、氣流量、濕度等進(jìn)行嚴(yán)格的控制。

方法：將實驗鼠放置在相對濕度低于 20%，溫度為21-23℃的受控環(huán)境中，連續(xù)14 d可在實驗鼠中誘導(dǎo)得到急性干眼癥。在無抗膽堿能藥物作用的情況下，將急性干眼癥小鼠轉(zhuǎn)移到溫度為21-23℃、相對濕度為40%-60% 的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中繼續(xù)維持4個月，可誘導(dǎo)形成慢性干眼癥。

特點：干燥環(huán)境刺激造模方法可與其他方法聯(lián)用，得到更加穩(wěn)定、嚴(yán)重的干眼癥模型。

六、干眼癥模型藥效評價指標(biāo)

1、一般情況：鼠是否好斗，及鼠掉毛、毛發(fā)斷裂、揉眼的情況；

2、眼表檢查：

動物干眼癥癥狀可通過裂隙燈檢查角膜、結(jié)膜等形態(tài)改變等進(jìn)行評判。裂隙燈主要觀察內(nèi)容包括：①淚河寬度有無變窄；②角膜上皮的角化程度，是否出現(xiàn)水泡、潰瘍、血管翳等異常；③角膜表層及下穹窿部有無碎屑；④結(jié)膜是否出現(xiàn)充血、乳頭增生等；結(jié)膜囊結(jié)膜有無松弛形成皺褶：⑤瞼緣是否充血；或出現(xiàn)不規(guī)整、增厚、外翻等；腺口是否有清亮或黃色漿液阻塞、腺管模糊等。早期或輕度的干眼癥動物模型裂隙燈檢查大都無明顯異常，須結(jié)合結(jié)膜熒光素染色試驗進(jìn)一步檢查。

結(jié)膜熒光素染色檢測方法：

滴2μL的1%熒光素鈉于眼球結(jié)膜囊內(nèi)，用0.25%氯霉素滴眼液進(jìn)行沖洗，通過裂隙燈顯微鏡對染色情況進(jìn)行等級評定。根據(jù)其著色程度和面積大小共分為四個等級：無染色為0分；散在稀疏的點狀染色為1分；較為密集的點狀染色為2分；染色呈片狀為3分，若點數(shù)不均以比例較大者為準(zhǔn)，評分越高角膜損傷越嚴(yán)重。

圖注：A: 空白組角膜熒光素染色無異常; B: 模型組角膜熒光素染色示中央角膜點片狀著色

3、淚液檢查：包括淚液分泌試驗和淚膜破裂時間。

3.1 淚液分泌試驗(Schirmer test)：

是對結(jié)膜受刺激后的基礎(chǔ)淚液和反射淚液總和的測量，可最直觀估量水樣液分泌。分別于干預(yù)第0天、7天、14 天時，腹腔麻醉或氣麻后拉開實驗鼠下瞼。

A:試紙法。用眼科顯微鑷將1 mm × 15 mm的淚液試紙置于大鼠下瞼外1 /3結(jié)膜囊內(nèi)，2 min后取出，迅速測量試紙濕潤長度(精確到0.5 mm) ，通常≥ 10 mm/5 min 為淚液分泌正常。每只大鼠重復(fù)檢測3次，計算平均值。

圖注：上：空白組；下：模型組

B:酚紅棉線浸漬法。用眼科顯微鑷將酚紅浸漬棉線置于大鼠下瞼外1 /3結(jié)膜囊內(nèi)，停留30s取出，棉線接觸淚液潤濕后顏色變紅，測量紅色棉線的長度(以mm為單位) 作為淚液分泌量的測量結(jié)果。

圖注：上：空白組；下：模型組

3.2 淚膜破裂時間(tear break up time，BUT) 

可分別于干預(yù)第0天、7天、14 天時檢測各組淚膜破裂時間。用1滴生理鹽水將熒光素鈉試紙浸濕，用該試紙尖端輕觸實驗鼠下眼瞼內(nèi)側(cè)并停留片刻，對實驗鼠輔助眨眼3次使熒光素分布均勻，于裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察角膜出現(xiàn)第1個黑色干燥斑點的時間，每只實驗鼠重復(fù)檢測3次，計算平均值。通常BUT＞10 s為正常。

4、淚液蕨類試驗 

實驗鼠眼部未使用表面麻醉藥物，點樣毛細(xì)玻璃管在下瞼結(jié)膜囊淚阜處利用虹吸作用吸取淚液標(biāo)本，盡量不接觸眼表。將淚液標(biāo)本涂至潔凈載玻片上，25 ℃ (空調(diào)控制溫度)下干燥10-20 min 后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察淚液蕨類物的形態(tài)并拍照。

圖注：A: 空白組淚液蕨類結(jié)晶圖像顯示形態(tài)良好的蕨類物形成；B: 模型組淚液蕨類結(jié)晶圖像分析顯示蕨類物邊界不清，中間連接的顏色逐漸變淺

5、角膜組織病理變化

 采用HE染色法。實驗結(jié)束后，用頸椎脫臼法處死鼠，取角膜組織于固定液中固定72 h，用梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋后制成厚度約為5 μm的組織切片，切片透明水化，HE染色、封片，于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化。

圖注：A: 空白組; B: 模型組

注：空白組和模型組的鼠角膜HE染色觀察可見上皮分層良好，分4-5層，基底部細(xì)胞排列呈柱狀，向角膜表面分化逐漸變成鱗狀上皮細(xì)胞。空白組角膜組織細(xì)胞正常，上皮層寬厚，基質(zhì)層細(xì)胞排列緊密，無明顯病理特征; 模型組角膜組織上皮層顯著變薄，基底層細(xì)胞部分缺失且排列疏松，上皮細(xì)胞分層紊亂，細(xì)胞層數(shù)減少，出現(xiàn)空泡。