關(guān)于上期我們聊到了基因鼠的起源與發(fā)展，今天就來跟大家分享怎么去鑒定它。

如何鑒定基因鼠

1.鑒定基因鼠可以取小鼠的腳趾或尾尖（<5mm），一般1-2mm即可獲得足夠量 DNA 用于基因型鑒定。斷趾操作一般剪取的鼠爪量為鼠爪趾尖組織，但若需要在剪趾作基因鑒定的同時(shí)，以剪趾作為小鼠的標(biāo)記，則應(yīng)盡量將整個(gè)腳趾剪下，以免后續(xù)組織長回愈合后分辨不清小鼠的編號(hào)。

2.剪趾或剪尾最好在出生后7-12天內(nèi)完成，一方面既可避免母鼠吃仔，另一方面該時(shí)段的大小鼠容易抓取、出血較少，提取的基因組質(zhì)量較高。

3.想要獲得正確的鑒定信息，首先要正確取樣，即避免小鼠在剪趾或剪尾過程的污染。如果上一只小鼠的血液和體液殘留在剪刀上，就會(huì)將它的 DNA 帶到下一只小鼠的組織上；而使用這樣的組織做鑒定，則會(huì)導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

正確的做法應(yīng)當(dāng)是在每一次剪鼠尾之前，都用75%酒精擦拭清潔剪刀；或準(zhǔn)備兩把剪刀輪流使用，用完的剪刀浸泡在75%酒精溶液中。

鑒定流程

取需要鑒定的小鼠鼠尾或腳趾，按試劑盒步驟提取DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，凝膠電泳鑒定。鑒定陽性后，可將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，從而進(jìn)一步確認(rèn)小鼠的基因型。

完全性基因敲除鼠的鑒定之一對(duì)引物

將引物設(shè)計(jì)在敲除區(qū)域的兩端，如下圖所示F1和R1引物。

敲除后的基因片段比原來的野生型基因片段要短，因而可以通過凝膠電泳看PCR產(chǎn)物的大小來判斷基因型。

預(yù)期的電泳結(jié)果示意圖如下：

若電泳結(jié)果只有條帶1，則判斷為陽性純合鼠（-/-)；若電泳結(jié)果只有條帶2，則判斷為野生鼠（＋/+)；若電泳結(jié)果有條帶1和條帶2，則為陽性雜合鼠（+/-）。

完全性基因敲除鼠的鑒定之兩對(duì)引物

若敲除的片段過大，不精提基因組或不使用高保真高擴(kuò)增效率的聚合酶，一般大于2,000 bp的條帶會(huì)較難擴(kuò)増。即圖示中敲除區(qū)域大于2,000 bp時(shí)，野生型條帶無法擴(kuò)增，電泳結(jié)果中將無條帶2。則只能區(qū)分野生型鼠和陽性鼠，無法判定陽性鼠是否為雜合或純合。此時(shí)就需要再設(shè)計(jì)一條位于敲除區(qū)域內(nèi)的引物R2（如下圖所示），使用3條引物用短片段體系即可判斷基因型。

預(yù)期的電泳結(jié)果示意圖如下：

若電泳結(jié)果只有條帶1，則判斷為陽性純合鼠（-/-)；若電泳結(jié)果只有條帶3，則判斷為野生鼠（+/+)；若電泳結(jié)果有條帶1和條帶3，則為陽性雜合鼠（+/-)。

若兩對(duì)引物預(yù)期片段大小相差僅幾十 bp ，在有實(shí)驗(yàn)誤差的情況下，同一膠圖可能較難區(qū)分兩條條帶。因此，一般是將三條引物分2個(gè)體系進(jìn)行，先判斷是否陽性，再進(jìn)一步判斷純雜合。

點(diǎn)突變小鼠的鑒定

許多疾病的發(fā)生和點(diǎn)突變更密切相關(guān)，所以構(gòu)建點(diǎn)突變的小鼠模型也很常見，但點(diǎn)突變小鼠的基因型鑒定稍復(fù)雜一些。由于點(diǎn)突變只是單堿基或少數(shù)堿基的增加、缺失或替換，在電泳圖上突變片段與野生型條帶的大小是無法區(qū)分的。因此，點(diǎn)突變小鼠除了PCR外，還需要結(jié)合測序或者酶切來鑒定。

選擇在發(fā)生點(diǎn)突變的上下游片段設(shè)計(jì)引物（如下圖所示）。若突變后的序列正好是某種酶特異識(shí)別的位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)還要使酶切點(diǎn)兩邊的片段大小有區(qū)分。

若突變后的序列正好是某種酶特異識(shí)別的位點(diǎn)，就可以用酶切實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。酶切成功則發(fā)生點(diǎn)突變的片段被切為兩段，野生型的不會(huì)被酶識(shí)別切割。反之，若突變前的序列正好是某種酶特異識(shí)別的位點(diǎn)，也可同理進(jìn)行鑒定。

但這兩種情況均極罕見。使用引物擴(kuò)增后電泳，通過條帶大小只能大概判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的基因。想要判斷是否有突變，還需要切膠回收，送去測序。測序結(jié)果可在DNAMAN等軟件上比對(duì)分析，即可判斷目的堿基是否有突變。

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