技術簡介

細胞永生化是指體外分離培養的原代細胞受到自發的或受外界因素的影響，避免了正常細胞的衰老死亡過程，從而具有無限增殖能力的過程。衰老死亡是一種正常的不可逆的細胞生理過程，正常組織來源的原代細胞在通常的體外培養條件下可分裂生長，但細胞在不斷增殖分裂的過程中會達到衰老M1期和致死M2期，細胞會停止分裂并啟動凋亡過程。此時如果細胞在某些原因誘導下，恢復基因的穩定性，則可以逃離衰老死亡的正常生理過程達到無限增殖分裂的永生化狀態。利用基因轉染等技術將外源性永生化基因導入目的細胞內，從而建立永生化細胞株，以達到使體外培養的細胞具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的。

哺乳動物細胞使用幾種方法誘導細胞永生化。其中猿猴病毒40（SV40）T抗原和hTERT病毒誘導的細胞永生化最為簡單可靠，應用廣泛。

SV40 T抗原

SV40主要由大T、小T和結構蛋白組成。SV40的大T抗原片段常用于整合入宿主細胞基因組并表達，通過調控細胞周期，致使細胞進入無限增殖的永生化狀態。目前對SV40轉染宿主細胞進入永生化的機制推測可能是SV40大T抗原片段與p53蛋白及其相關蛋白結合形成復合體導致p53蛋白失活，使抑癌基因失效無法表達，從而防止細胞分裂停滯，調整宿主細胞周期，從而永生化。

端粒-端粒酶激活

端粒是維持染色體穩定、細胞壽命的重要結果，其長度與染色體復制次數成反比，由于端粒長短有限，一旦減少到極值，便不再具有保護染色體穩定的作用，隨之發生細胞死亡。但是端粒中含有一種逆轉錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補端粒的長度，使細胞持續生長。但是TERT通常在正常的真核細胞中是不被表達的，需要轉基因等技術手段，構建真核表達載體，通過轉染細胞繼而實現細胞永生化。

    操作流程

   服務內容

1.  原代細胞分離純化；

2.  永生化基因的慢病毒制備；

3.  慢病毒感染原代細胞并進行傳代培養；

4.  永生化混合細胞進行抗生素篩選；

5.  永生化細胞系進行端粒酶基因表達和衰老檢測。

   增值服務

1.  永生化細胞核型分析

2.  流式檢測表面蛋白標記

3.  干細胞畸胎瘤形成檢測實驗

   項目案例

  以人間充質干細胞為例，展示永生化細胞制備、鑒定的相關結果

（1）     細胞形態圖（抗生素篩選）

（2）     端粒酶表達檢測

（3）     衰老檢測