今天和大家分享一篇發(fā)表在Mol Ther Nucleic Acids.有關(guān)RNA測(cè)序、分析+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的文章。題目為：Preeclampsia-Associated lncRNA INHBA-AS1 Regulates the Proliferation, Invasion, and Migration of Placental Trophoblast Cells。

研究背景：

子癇前期（preeclampsia, PE）是妊娠期特有的綜合征，主要表現(xiàn)為妊娠20周后新發(fā)高血壓和蛋白尿，可伴有其他系統(tǒng)疾病表現(xiàn)。目前子癇前期的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究認(rèn)為其可能的機(jī)制包括：血管內(nèi)皮受損、 炎癥免疫過度激活、營養(yǎng)缺乏、遺傳因素、胰島素抵抗等，發(fā)病主要可能與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙有關(guān)。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）是指轉(zhuǎn)錄本長度超過200核苷酸數(shù)（nucleotide，nt） 的RNA分子。已有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在子癇前期患者胎盤中相對(duì)正常對(duì)照組出現(xiàn)異常表達(dá)，并影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等功能。如 IGF2 /H19 MEG3， SPRY4-IT1，HOTAIR， MALAT1， FLT1P1 CEACAMP8 可以通過甲基化、 Notch-EGFL7 信號(hào)通路、Wnt /β-catenin 信號(hào)通路等方式導(dǎo)致子癇前期。LncRNA-mRNA 共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其在脂質(zhì)代謝和 2 型免疫應(yīng)答等通路中均有顯著參與， 這與子癇前期相對(duì)正常妊娠其代謝和免疫狀態(tài)受到影響的理論一致。

研究方法：作者所在的研究團(tuán)隊(duì)收集了2015年5月－2016年1月南方醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)分娩的9例重癥早發(fā)子癇前期(early-onset severe preeclampsia, EOSPE)及32例正常對(duì)照組胎盤組織樣本進(jìn)行RNA測(cè)序，通過測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在重癥早發(fā)子癇前期患者胎盤中相對(duì)正常對(duì)照組高表達(dá)的lncRNA INHBA-AS1(INHBA antisense RNA 1)。進(jìn)一步收集2016年5月－2017年1月南方醫(yī)院產(chǎn)科剖宮產(chǎn)分娩的27例子癇前期和31例正常對(duì)照組胎盤樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)驗(yàn)證，同樣顯示lncRNA INHBA-AS1在子癇前期中表達(dá)顯著上調(diào)。接著在滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo中研究lncRNA INHBA-AS1的生物學(xué)功能和可能的作用機(jī)制；同時(shí)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除lncRNA INHBA-AS1后，進(jìn)一步研究其功能；通過熒光原位雜交（Fluorescent In Situ Hybridization， FISH）和核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)定位lncRNA INHBA-AS1。接下來通過RNA pull down實(shí)驗(yàn)對(duì)lncRNA INHBA-AS1結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析， 對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行GO-CC分析；通過生信分析尋找受lncRNA INHBA-AS1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，通過RIP實(shí)驗(yàn)反向驗(yàn)證了lncRNA INHBAAS1與分析結(jié)果中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。進(jìn)一步利用CHIP和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明lncRNA INHBAAS1結(jié)合相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，靶基因可以影響侵襲/遷移相關(guān)通路蛋白MMP2、 MMP3、 Vimentin。

研究結(jié)果：

1. LncRNA INHBA-AS1 在 EOSPE 胎盤中高表達(dá)

在作者的前期研究中，采集了9例EOSPE胎盤樣本和32例正常對(duì)照組胎盤樣本，進(jìn)行RNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示lncRNA INHBA-AS1 在 EOSPE胎盤樣本中相對(duì)正常對(duì)照組表達(dá)量升高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)85%(23/27)的子癇前期患者胎盤lncRNA INHBA-AS1 明顯上調(diào)。并且發(fā)現(xiàn)孕婦收縮壓與 lncRNA INHBA-AS1 的表達(dá)量呈正相關(guān)。 孕婦舒張壓與 lncRNA INHBAAS1 表達(dá)量的相關(guān)性結(jié)果同樣呈正相關(guān)。提示 lncRNA INHBA-AS1 與患者的一些臨床數(shù)據(jù)關(guān)系密切。為了確定 INHBA-AS1-蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能性細(xì)胞

定位，進(jìn)行 Gene Ontology (GO)富集分析， 發(fā)現(xiàn) lncRNA INHBA-AS1 結(jié)合蛋白可能與細(xì)胞核中的復(fù)合物相關(guān)。

2. LncRNA INHBA-AS1影響滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能

作者通過在HTR-8/SVneo 細(xì)胞中過表達(dá)和敲除LncRNA INHBA-AS1，對(duì)功能進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)lncRNA INHBA-AS1抑制HTR-8/SVneo 細(xì)胞的侵襲/遷移、增殖能力；促進(jìn)了凋亡能力。刪除 lncRNA INHBA-AS1 促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲/遷移、增殖能力，抑制了凋亡能力。

3.INHBA-AS1 結(jié)合 CENPB 調(diào)控 INHBA 和 TRAF1

作者利用FISH和細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)對(duì)INHBA-AS1的定位進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn) lncRNA INHBA-AS1主要在細(xì)胞核中表達(dá)，說明lncRNA INHBA-AS1可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。為了尋找與 lncRNA INHBA-AS1 結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)到lncRNA INHBA-AS1 蛋白復(fù)合物中的 167 個(gè)蛋白，其中有45個(gè)轉(zhuǎn)錄因子顯示出顯著的富集。為了確定 INHBA-AS1-蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能性細(xì)胞定位，進(jìn)行 Gene Ontology (GO)富集分析，發(fā)現(xiàn) lncRNA INHBA-AS1 結(jié)合蛋白可能與細(xì)胞核中的復(fù)合物相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 lncRNA INHBAAS1 位于細(xì)胞核中并參與轉(zhuǎn)錄或其相關(guān)過程。同時(shí)作者通過生信分析方法，構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄因子-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)CENPB具有第二高的中介中心性。說明CENPB可能在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 lncRNA INHBA-AS1 與轉(zhuǎn)錄因子 CENPB 結(jié)合，作者通過 RNA 免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了反向驗(yàn)證，得出了一致的結(jié)論。

4.CENPB 通過結(jié)合 INHBA 和 TRAF1 的啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄

為了研究轉(zhuǎn)錄因子CENPB對(duì)INHBA和TRAF1的影響，作者建立HTR-8/SVneo細(xì)胞的CENPB過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)INHBA 和 TRAF1 的 mRNA 和蛋白水平均較對(duì)照組升高，相反， 當(dāng) HTR-8/SVneo 細(xì)胞中 CENPB 被敲除時(shí)，INHBA 和 TRAF1 的 mRNA 水平和蛋白水平較對(duì)照組下降。同時(shí)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢證實(shí) CENPB 與 INHBA 和 TRAF1 啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合。 接下來，通過熒光素酶報(bào)告基因實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè) HTR-8/SVneo細(xì)胞系、INHBA-AS1過表達(dá)細(xì)胞系、INHBA- AS1敲除細(xì)胞系中，INHBA啟動(dòng)子區(qū)域片段(INHBA-2)和TRAF1啟動(dòng)子區(qū)域片段(TRAF1-3)啟動(dòng)子活性的改變。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示 lncRNA INHBA- AS1 抑制 CENPB 對(duì)INHBA 和 TRAF1 啟動(dòng)子的促轉(zhuǎn)錄作用。

5. INHBA-AS1通過INHBA和TRAF1對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲/遷移發(fā)揮作用

作者通過前期的生信分析和實(shí)驗(yàn)證明lncRNA INHBA-AS1通過結(jié)合CENPB抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移，且CENPB可以結(jié)合INHBA和TRAF1 的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步確認(rèn) lncRNA INHBA-AS1 在 HTR-8 / SVneo 細(xì)胞中通過結(jié)合 CENPB調(diào)節(jié)INHBA 和TRAF1 的轉(zhuǎn)錄，作者在 HTR-8 / SVneo 細(xì)胞中分別過表達(dá) lncRNAINHBA-AS1, INHBA, TRAF1以及在過表達(dá) INHBA-AS1 的 HTR-8 /Svneo 穩(wěn)定細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染空載 pcDNA3.1， pcDNA3.1-INHBA， pcDNA3.1-TRAF1。結(jié)果提示，過表達(dá)INHBA-AS1可以抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移，而INHBA或TRAF1 可部分恢復(fù) HTR-8/SVneo 細(xì)胞被 INHBA- AS1 所阻斷的侵襲和遷移功能，接下來也檢測(cè)到了MMP2、MMP3和Vimentin 這幾個(gè)參與細(xì)胞侵襲和遷移通路的關(guān)鍵分子在 HTR-8 / SVneo 細(xì)胞過表達(dá) INHBA 和 TRAF1后出現(xiàn)上調(diào)。在敲除 INHBA-AS1的HTR-8 / Svneo穩(wěn)定細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染 si-NC，si-INHBA，si- TRAF1。Transwell 結(jié)果顯示敲除INHBA-AS1 促進(jìn)了 HTR-8/SVneo 細(xì)胞的侵襲和遷移，進(jìn)一步敲低 INHBA 或TRAF1 可部分抑制 INHBA-AS1 對(duì) HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲和遷移能力的促進(jìn)作用。與此同時(shí)，敲低 INHBA 或 TRAF1 后，MMP2、MMP3、Vimentin等侵襲遷移標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)。

總結(jié)：

作者通過對(duì)EOSPE患者胎盤進(jìn)行RNA測(cè)序，生信分析結(jié)果提示，lncRNA INHBA-AS1的表達(dá)量存在顯著差異。通過擴(kuò)大樣本收集子癇前期患者胎盤與正常產(chǎn)婦胎盤，進(jìn)一步驗(yàn)證了 lncRNA INHBA-AS1在子癇前期患者胎盤中表達(dá)量升高，且發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平與孕婦血壓呈正相關(guān)。進(jìn)一步探究 lncRNA INHBA-AS1的上調(diào)如何參與子癇前期的發(fā)病。通過生信分析及實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lncRNA INHBA- AS1與轉(zhuǎn)錄因子CENPB結(jié)合，從而抑制下游靶基因INHBA、TRAF1的轉(zhuǎn)錄， 影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移，從而參與子癇前期的發(fā)病機(jī)制。