近日，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系李學(xué)農(nóng)教授團隊在國際權(quán)威期刊《Molecular Cancer》（中科院SCI分區(qū)小類1區(qū)，影響因子41.44）上刊發(fā)了題為“circEXOC6B interacting with RRAGB, an mTORC1 activator, inhibits the progression of colorectal cancer by antagonizing the HIF1ARRAGBmTORC1 positive feedback loop”的研究論文。該文作者通過高通量測序篩選及qPCR等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了在結(jié)直腸癌顯著下調(diào)的環(huán)狀RNA circEXOC6B，闡明了環(huán)狀RNA circEXOC6B與RRAGB結(jié)合抑制其異源二聚體的形成，破壞其與RRAGC /D的相互作用，從而阻斷mTORC1通路對營養(yǎng)的感知，抑制HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋環(huán)，使腫瘤細胞生長受到抑制并增強常用化療藥物5-FU誘導(dǎo)的凋亡。

研究背景

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率第二，死亡率排名第三的惡性腫瘤，常用的放化療治療方法產(chǎn)生的耐藥性嚴重限制了治療效果，探索結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制是改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。近年來，越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和化療耐藥性中起著至關(guān)重要的作用。使用高通量RNA測序，作者先前發(fā)現(xiàn)circEXOC6B在結(jié)腸癌中表達下調(diào)。然而，其在結(jié)直腸癌（CRC）中的作用和機制仍然未知。

研究方法

通過qRT-PCR實驗檢測CRC組織中circEXOC6B的表達,進行體內(nèi)和體外功能實驗以確定circEXOC6B對CRC發(fā)展的抑制作用,通過RNA-pull down、質(zhì)譜、co-IP、熒光原位雜交和免疫熒光，研究circEXOC6B與CRC生長和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細胞凋亡的可能機制。進行染色質(zhì)免疫沉淀、雙熒光素酶測定、Western Blot和免疫組化實驗用于探討HIF1A調(diào)節(jié)RRAGB轉(zhuǎn)錄的機制。

研究結(jié)果

1. circEXOC6B在CRC組織中表達下調(diào)

作者首先通過qRT-PCR實驗測定CRC組織中circEXOC6B的表達，如圖1A所示，與相鄰的非癌組織（正常）相比，在78例CRC組織（癌癥）中，circEXOC6B表達下調(diào)。為了探索circEXOC6B表達與CRC患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，再將78例CRC患者分為高表達組和低表達組（n=?39），根據(jù)circEXOC6B的中值表達進行統(tǒng)計分析，表明circEXOC6B的表達與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負相關(guān)（圖1B和表S3）。此外，還檢測了結(jié)腸癌cDNA芯片中circEXOC6B的表達，該芯片包含80例癌組織和15例癌旁組織。qRT-PCR結(jié)果顯示，circEXOC6B在癌組織中的表達也低于匹配的相鄰（正常）組織（圖1C）。Kaplan-Meier生存分析顯示，circEXOC6B高表達患者的總生存率（OS）（54.8%）高于circEXOC6B低表達患者總生存率（OS）（20.6%）（P=?0.042）（圖1D）。circEXOC6B表達較高的患者死亡風(fēng)險較低（圖1E）。最后，多元回歸分析進一步證實，高circEXOC6B表達可將死亡風(fēng)險降低49.4%（圖1F）。這些結(jié)果表明，circEXOC6B的表達與與CRC患者總生存期相關(guān)。

2. 體外實驗和在體實驗表明，circEXOC6B可抑制CRC細胞的生長

為了研究circEXOC6B在CRC進展中的作用，作者使用特異性靶向circEXOC6B的siRNA敲低了CRC細胞中circEXOC6B的表達，并使用circEXOC6B過表達載體上調(diào)了circEX0C6B的基因表達（圖2A和S2A）。流式細胞術(shù)和CCK8、EdU和集落形成實驗表明，敲低circEXOC6B的表達促進CRC細胞的增殖、克隆形成和細胞周期，而過表達circEXOC6B則抑制癌細胞生存能力和克隆形成（圖2B–D和S2B–E）。此外，流式實驗結(jié)果表明，敲低circEXOC6B抑制了5-FU誘導(dǎo)的CRC細胞凋亡，而過表達circEXOC6B濃度具有相反的作用（圖2E）。

3. circEXOC6B與RRAGB結(jié)合，干擾其異二聚體的形成

為了探索circEXOC6B調(diào)控CRC進展的分子機制，首先使用FISH、PCR和qRT-PCR檢測了circEXOC6B在CRC細胞系和CRC臨床樣本中的亞細胞定位。結(jié)果表明，circEXOC6B主要存在于CRC細胞的細胞質(zhì)中（圖3A和S4）。細胞質(zhì)中的circRNAs可以與miRNA或蛋白質(zhì)相互作用，它們與蛋白質(zhì)的結(jié)合被認為是它們的主要功能。為了鑒定與circEXOC6B相互作用的蛋白質(zhì)，作者在SW620和HCT116細胞中進行RNA-pull down，隨后，通過質(zhì)譜分析鑒定了17種蛋白質(zhì)。其中，RRAGB是與circEXOC6B結(jié)合的候選蛋白。通過RNA-pull down實驗，再進行western blot實驗，證實了circEXOC6B和RRAGB的結(jié)合（圖3C）。此外，RIP實驗驗證了RRAGB可以富集circEXOC6B（圖3D）。為了進一步證實circEXOC6B和RRAGB的相互作用，在CRC細胞中使用FISH和IF標(biāo)記circEXOC6B和RLAGB。結(jié)果顯示，在CRC細胞的細胞質(zhì)中，circEXOC6B和RRAGB共定位。此外，使用catRAPID數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了RRAGB與circEXOC6B的可能結(jié)合位點。結(jié)果表明，RRAGB中circEXOC6B結(jié)合的最可能區(qū)域位于250 aa位點附近（圖S6）。因此，作者構(gòu)建了不同長度的RRAGB表達載體（圖3F）。RIP分析顯示，RRAGB的223–346 aa區(qū)域與circEXOC6B的相互作用（圖3G）。有趣的是，該區(qū)域包含RRAGB與RRAGC/D異二聚體的結(jié)合位點（圖3H）。因此，作者推測，circEXOC6B可能會競爭性地干擾RRAGB–RRAGC/D異二聚體的形成。為了驗證這一假設(shè)，用標(biāo)記RRAGB表達載體轉(zhuǎn)染CRC細胞后，對其進行了Co-IP測定。Western blot結(jié)果顯示，RRAGC和RRAGD與RRAGB的結(jié)合隨著circEXOC6B的過度表達而降低（圖3I）。這些結(jié)果表明，circEXOC6B可以與RRAGB結(jié)合，并抑制RRAGB和RRAGC/D的異二聚體形成。

4. circEXOC6B抑制mTORC1通路

鑒于激活mTORC1途徑需要RRAGB-RAGC/D異二聚體的形成，我們推斷，circEXOC6B可能通過干擾異二聚物的形成來抑制mTORC1通路。Western blot結(jié)果顯示，circEXOC6B的過表達降低了p-mTOR、p-S6K和HIF1A的表達，而其下調(diào)增加了它們的表達（圖4A和B）。與Western Blot結(jié)果一致，IHC表明皮下腫瘤中p-mTOR和HIF1A表達也上調(diào)，circEXOC6B表達穩(wěn)定沉默（圖4C）。此外，作者進行了挽救試驗，以進一步驗證RRAGB參與mTORC1通路中circEXOC6B的調(diào)節(jié)。WesternBlot實驗顯示，RRAGB引起的p-mTOR、p-S6K和HIF1A升高可以通過與circEXOC6B共轉(zhuǎn)染來逆轉(zhuǎn)（圖4D）。RRAGB誘導(dǎo)的CRC細胞的增殖和克隆形成性增強也可以通過circEXOC6B的過度表達來挽救（圖4E-G）。這些結(jié)果支持以下假設(shè)：circEXOC6B通過競爭性結(jié)合RRAGB抑制mTORC1途徑以促進CRC生長。

5. CRC具有HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路，該回路被circEXOC6B拮抗

作者使用qRT-PCR實驗檢測六種CRC細胞系中HIF1A和RRAGB的表達時，驚奇地發(fā)現(xiàn)HIF1A與RRAGB表達之間存在正相關(guān)（圖5B）。此外，HIF1A和RRAGB的表達水平在26個CRC組織中也呈正相關(guān)（圖5A）。同時使用GEO（圖S7A）和癌癥基因組圖譜（TCGA）（圖S7B）數(shù)據(jù)集進一步驗證了它們在CRC中的正相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)促使作者去探索HIF1A和RRAGB表達之間是否存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控。qRT-PCR實驗結(jié)果顯示HIF1A的敲低導(dǎo)致RRAGB mRNA表達的下調(diào)，而RRAGB的過表達對HIF1A mRNA表達沒有影響（圖5C）。同時作者也發(fā)現(xiàn)RRAGB的啟動子區(qū)包含三個HRE（RCGTG），它們是轉(zhuǎn)錄因子HIF1A的結(jié)合位點（圖5C）。隨后的ChIP實驗表明HIF1A與啟動子的第二個HRE位點結(jié)合（圖5D）。隨后，作者構(gòu)建了RRAGBWt和RRAGBMut（突變HRE）熒光素酶報告基因載體，進行雙熒光素素酶報告基因?qū)嶒灒▓D5E）。結(jié)果表明，敲低HIF1A表達后，熒光素酶活性降低，但使用HIF1A激活劑ML228過度表達HIF1A后，熒光素酶活力增加（圖5E）。這些結(jié)果表明HIF1A可以與RRAGB的啟動子結(jié)合并促進RRAGB轉(zhuǎn)錄。mTORC1通路促進HIF1A的翻譯。因此，HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋環(huán)存在于CRC中，以促進腫瘤進展，而circEXOC6B可能通過與RRAGB結(jié)合來拮抗該環(huán)。作者使用HIF1A激活劑ML228上調(diào)HIF1A，Western Blot結(jié)果顯示RRAGB水平升高。然而，circEXOC6B能夠消除該效應(yīng)并降低RRAGB和HIF1A的表達（圖5F）。此外，circEXOC6B的過表達下調(diào)了RRAGB的表達，而circEXOC6B的敲低則提高了RRAGG的表達（圖5G和H）。與Western Blot結(jié)果一致，IHC結(jié)果顯示circEXOC6B表達穩(wěn)定沉默的皮下腫瘤比對照組具有更高的RRAGB表達（圖5I）。為了進一步驗證circEXOC6B在正反饋回路中的抑制作用，使用IHC評估了22個CRC臨床樣本中HIF1A、RRAGB和p-mTOR的表達，包括11例circEXOC6B低表達和11例circEXOC6B高表達。結(jié)果表明，HIF1A、RRAGB和p-mTOR水平在高circEXOC6B組中低于低circEXOC6B組（圖S8）。

6.circEXOC6B增強CRC細胞對5-FU的敏感性

5-FU被廣泛用作CRC的一線化療藥物。然而，5-FU的有效性因固有或獲得性化療耐藥性而降低。近年來，mTORC1和HIF1A通路的激活被認為是5-FU耐藥的關(guān)鍵原因。之前的流式實驗數(shù)據(jù)如圖2E所示，表明circEXOC6B促進了5-FU誘導(dǎo)的CRC細胞凋亡。此外，發(fā)現(xiàn)5-FU敏感細胞系RKO、LoVo、HCT116和HT-29中circEXOC6B的表達高于5-FU非敏感細胞系SW620（癌癥數(shù)據(jù)庫中藥物敏感性基因組：https://www.cancerrxgene.org/)（圖S9）。因此，circEXOC6B可能通過抑制HIF1A-RAGB-mTORC1正反饋回路來增強CRC細胞對5-FU治療的敏感性。為了進一步評估circEXOC6B對5-FU治療的影響，進行TUNEL檢測5-FU誘導(dǎo)的細胞凋亡實驗。結(jié)果表明，較低的circEXOC6B表達減少了5-FU誘導(dǎo)的CRC細胞凋亡，而較高的circEXOC6B的表達使CRC細胞對5-FU治療更敏感（圖6A）。此外，circEXOC6B的敲低降低了凋亡標(biāo)志物裂解caspase-3和裂解PARP的表達，而其過度表達增加了其表達（圖6B）。與凋亡結(jié)果一致，CCK8測定顯示circEXOC6B的下調(diào)拮抗了5-FU在CRC細胞增殖中的抑制作用。相反，circEXOC6B的上調(diào)增強了5-FU對增殖的影響（圖6C）。此外，通過構(gòu)建裸鼠成瘤，以測試circEXOC6B在體內(nèi)5-FU治療中的作用。腹腔注射5-FU后，sh-circEXOC6B組的腫瘤體積與未治療組無差異。相比之下，5-FU治療后，sh-NC組的腫瘤大小顯著減?。▓D6D和E）。此外，在sh-circEXOC6B組中，凋亡標(biāo)志物裂解的caspase-3的表達沒有增加，但在sh-NC組中顯著升高（圖6F）。與caspase-3的表達一致，TUNEL結(jié)果顯示，5-FU治療后，sh-circEXOC6B組的凋亡沒有變化，而5-FU處理后，sh-NC組的凋亡顯著增加（圖6G）。這些發(fā)現(xiàn)表明，circEXOC6B增強了CRC細胞對5-FU的敏感性。

結(jié)論

本研究揭示了HIF1A-RRAGB-mTORC1正反饋回路的存在，該回路驅(qū)動結(jié)直腸癌的惡性演進， 而circEXOC6B抑制結(jié)直腸癌的生長并增加5-FU誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞凋亡（附圖）。這些結(jié)果為HIF1A和mTORC1通路之間的串?dāng)_提供了新的見解，并提出了阻斷結(jié)直腸癌進展的潛在治療靶點，揭示了環(huán)狀RNA調(diào)控結(jié)直腸癌生長及化療敏感性的新機制，為尋求結(jié)直腸癌治療新靶點提供了新的技術(shù)途徑。