一、胚胎移植的概念

1、胚胎移植(embryo transfer，ET)

指將一只雌性動(dòng)物的早期胚胎(或受精卵)取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎(或受精卵)，移植到另一只同種生理狀態(tài)相同的雌性動(dòng)物的體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體的技術(shù)，又稱之為“人工受胎” 或“借腹懷胎”。其中提供胚胎的個(gè)體稱為供體(donor)，接受胚胎的個(gè)體稱為受體(recipient)。

2、胚胎移植程序

（1）供、受體的同步發(fā)情；

（2）供體的超數(shù)排卵和配種；

（3）胚胎的采集；

（4）胚胎的質(zhì)量鑒定；

（5）胚胎的移植；

二、供體及受體的同步發(fā)情方法

同步發(fā)情 (estrus synchronization)是使供、受體動(dòng)物在同一時(shí)期內(nèi)同時(shí)發(fā)情、同期排卵的技術(shù)，是胚胎移植的前提，供、受體只有發(fā)情同期化，其生殖道的內(nèi)環(huán)境才能一致，才能使移植的異體動(dòng)物的胚胎著床。

同步發(fā)情的原理是通過(guò)外源激素的調(diào)節(jié)，控制供、受體的動(dòng)物的發(fā)情排卵在同一時(shí)間發(fā)生。其策略有二：1是使黃體期縮短，2是使黃體期延長(zhǎng)。

圖注：A:自然發(fā)情周期；B:縮短黃體期(前列腺素F2a處理法) ；C:延長(zhǎng)黃體期(孕激素處理法)

三、供、載體的超數(shù)排卵和配種法

在動(dòng)物發(fā)情周期的適當(dāng)時(shí)間，注射外源促性腺激素，使卵巢比自然發(fā)情時(shí)有更多的卵泡發(fā)育并排卵，這種方法稱為超數(shù)排卵(superovulation)， 簡(jiǎn)稱超排。動(dòng)物卵巢上約有99%的有腔卵泡發(fā)生閉鎖而退化，只有1%能發(fā)育成熟而排卵。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物的黃體期結(jié)束之后，卵泡期啟動(dòng)之前，注射促性腺激素，能使卵泡不發(fā)生閉鎖而正常發(fā)育，在排卵之前再注射黃體生成素(LH)或人絨毛膜促性腺激素(HCG) 補(bǔ)充內(nèi)源性的黃體生成素(LH)不足，可保證多數(shù)卵泡成熟、排卵。

對(duì)動(dòng)物做超數(shù)排卵處理的常用激素有：孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH) 等。

1、經(jīng)過(guò)超數(shù)排卵處理的動(dòng)物發(fā)情后應(yīng)適時(shí)配種；

2、由于超排時(shí)的生殖道環(huán)境與自然發(fā)情差異較大，為保證排出的卵子能及時(shí)受精，應(yīng)使用活率高、密度大的精液，而且輸精次數(shù)和每次輸精的有效精子數(shù)至少要增加1倍。

圖注：A（左）、B（右）：不同活率及密度的精液對(duì)比

供體：正常母鼠腹腔注射50μLPMSG，相隔48h后，再腹腔注射等量HGG，當(dāng)日與正常雄鼠1:1合籠交配，次日檢栓(陰道涂片觀察)，見(jiàn)栓當(dāng)日為妊娠第1日。

制備假孕母鼠：首先要獲得結(jié)扎公鼠。將 6～8 周齡的公鼠，麻醉，腹部手術(shù)，將兩側(cè)的輸管結(jié)扎，縫合，休息 4 周以上備用。在供體小鼠合籠后的12-24h內(nèi)，將準(zhǔn)備作受體的雌性小鼠與扎公鼠合籠(1:1)。第二天清晨檢查陰栓，有陰道栓者為假孕母鼠。

圖注：A：公鼠與母鼠合籠；B：陰道栓觀察

四、胚胎的采集

胚胎采集又稱沖卵、采胚，它是利用特定的溶液和裝置將早期胚胎從母體的子宮或輸卵管中沖出并回收利用的過(guò)程。胚胎的沖洗采用腹部切開的手術(shù)法。要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求從不同的部位沖取不同發(fā)育階段的胚胎。沖洗時(shí)要考慮配種時(shí)間、排卵時(shí)間、胚胎位置，才能得到較高的收集率。

圖注：輸卵管采胚法：一般是用帶有磨鈍針頭的注射器刺入子宮角頂端，注入沖胚液，然后從輸卵管的傘部接取沖胚液(上行法，圖A（左）)，也可與之相反方向沖取(下行法，圖B（右）)

圖注：子宮角采胚法 ：按上圖的方法對(duì)子宮角進(jìn)行上行或下行法沖洗，采集胚胎。

五、胚胎的質(zhì)量鑒定

胚胎的鑒定是指應(yīng)用各種手段對(duì)胚胎質(zhì)量和活力進(jìn)行評(píng)定或等級(jí)分類。生產(chǎn)中常用形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行胚胎的級(jí)別鑒定，就是將體視鏡的放大倍數(shù)調(diào)至 80～100倍，通過(guò)觀察胚胎的形態(tài)、卵裂球大小與均勻度、色澤、細(xì)胞密度、與透明帶間隙以及細(xì)胞變性等情況，將胚胎進(jìn)行質(zhì)量分級(jí)。

在國(guó)內(nèi)，胚胎按質(zhì)量的高低被分為 A、 B、 C和D四級(jí)，與國(guó)際上的1、2、3和4級(jí)相應(yīng)，具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下表。正常發(fā)育的胚胎，其中卵裂球一般外形整齊清晰，大小一致，分布勻而緊密，發(fā)育速度與胚胎日齡相一致。對(duì)發(fā)育正常的胚胎供移植或體外培養(yǎng)和保存。胚胎質(zhì)量和活力鑒定除了形態(tài)學(xué)方法外，還有體外培養(yǎng)法、熒光法(活體染色法)、測(cè)定代謝活性和胚胎的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖注：不同發(fā)育階段的早期胚胎以及異常卵的形態(tài)

六、胚胎移植

1、移入路徑

（1）不加培養(yǎng)的胚胎：

從輸卵管沖出的胚胎應(yīng)移入受體的輸卵管內(nèi)；

從子宮角沖出的胚胎應(yīng)移入受體的子宮角內(nèi)。

（2）經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的胚胎：

體外生產(chǎn)的胚胎，則要根據(jù)胚胎發(fā)育的階段，移入相應(yīng)的部位。

2、數(shù)量

（1）單胎動(dòng)物：

移入1～2枚合格的胚胎即可；

（2）多胎動(dòng)物：

至少要移入4 枚以上的胚胎，才能產(chǎn)生足夠的妊娠信號(hào)，使胚胎著床(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般為多胎動(dòng)物)

3、手法

各種動(dòng)物的生理特點(diǎn)不同，胚胎移植的操作也有差異。

圖注：手術(shù)法將胚胎移入輸卵管

圖注：手術(shù)法將胚胎移入子宮角

七、實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。術(shù)前禁食12 h(不禁水)。將實(shí)驗(yàn)鼠放進(jìn)連接好的麻醉機(jī)誘導(dǎo)箱，調(diào)整異氟烷濃度至5%，完成誘導(dǎo)麻醉后將實(shí)驗(yàn)鼠仰臥位固定在手術(shù)板上；

2、調(diào)整異氟烷濃度至2%，連接面罩并持續(xù)吸入。手術(shù)期間氣體麻醉維持。實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)喉氣管插管與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接，調(diào)整呼吸機(jī)呼吸頻率、呼吸比與潮氣量；

3、術(shù)前、術(shù)后注意維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體溫(恒溫墊控制溫度37 ℃)；

4、子宮內(nèi)移植的手術(shù)難度較小，但只適用于從桑椹胚到囊胚期階段的胚胎。方法是選見(jiàn)陰栓第2.5天或第3.5天的懷孕或假孕雌鼠。背位開一口，在子宮角靠輸卵管部位選血管分布少的部位，用4號(hào)針扎一小孔，然后用玻璃微管把桑椹胚或囊胚期的胚胎移入。無(wú)論何部位的移植?都應(yīng)盡量避免帶入多余的培養(yǎng)液或氣泡；

5、每次移入操作后應(yīng)將移植管尖端浸入培養(yǎng)液中在解剖鏡下檢查移植管中有無(wú)余留胚胎。若有應(yīng)再次補(bǔ)移。為確定移入胚胎的分布可在移入后的第 10 天或18.5天打開腹腔檢查移植胚胎的植入或分布以及胎兒成活情況。

八、實(shí)驗(yàn)成果展示

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

總結(jié)：相同品系的balb/c鼠的胚胎移植成功率最高，balb/c 鼠與C57鼠的胚胎移植率最低，其中其他基因型鼠的胚胎移植率高可能受到遺傳特性的影響

九、實(shí)驗(yàn)總結(jié)

1、胚胎存放時(shí)間：胚胎沖出后，應(yīng)立即檢出和進(jìn)行胚胎形態(tài)鑒定，胚胎在體外或室溫下存放時(shí)間越短越好；

2、移植針標(biāo)準(zhǔn)：移植針在酒精燈上徒手拉制要求一定要細(xì)，不合格的不能用，這樣才能在虹吸時(shí)不帶走多余的液體，以確保胚胎著床率；

3、子宮角定位：在針刺子宮角時(shí)，對(duì)子宮角的不當(dāng)固定或過(guò)度牽拉，將導(dǎo)致子宮的損傷、瘀血等，影響小鼠受孕；

4、受體的準(zhǔn)備：在胚胎移植中，胚胎最終必須移植到合適的受體中才能妊娠，因?yàn)槭荏w的生殖、生理狀態(tài)對(duì)妊娠率有很大的影響，因此受體的準(zhǔn)備非常重要，要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選，受體的選擇要求營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和性周期正常，移植時(shí)卵巢有紅體存在。胚胎檢出后，應(yīng)立即對(duì)受體實(shí)施麻醉及移植手術(shù)，應(yīng)盡快在短時(shí)間內(nèi)將胚胎移入受體子宮內(nèi)；

5、無(wú)菌操作：在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，一定要注意保持無(wú)菌，無(wú)論是對(duì)供、受體的污染，還是對(duì)胚胎的污染，在一定程度上都會(huì)對(duì)胚胎和妊娠環(huán)境有不良刺激，降低胚胎質(zhì)量和移植妊娠率，從而影響胚胎移植質(zhì)量；

6、胚胎保存：在撿、洗胚胎的PBS液中，一定要加入適量的新生牛血清，以防止胚胎下沉后與表面皿底部貼壁，撿、洗胚胎完成后，應(yīng)將其放入37度恒溫箱內(nèi)，同時(shí)，還要防止表面皿中液體過(guò)少而蒸發(fā)干，在體視顯微鏡下進(jìn)行撿胚時(shí)，速度盡量快，防止因?yàn)轶w視顯微鏡的燈光很熱及長(zhǎng)時(shí)間的燒烤導(dǎo)致胚胎死亡；

7、移植操作技術(shù)：手術(shù)中，在往子宮角吹入胚胎時(shí)，推壓注射器活塞的速度一定要慢，力度要把握適當(dāng)，以防將空氣注入子宮內(nèi)而影響到移入胚胎在受體鼠子宮內(nèi)的著床。操作水平的高低會(huì)直接影響移植妊娠率，主要包括對(duì)胚胎和受體的移植部位的不同技術(shù)的操作，熟練的操作者手法輕柔迅速，可以大大縮短操作時(shí)間，減少對(duì)子宮和胚胎的損傷；

8、調(diào)整移植針尖：手術(shù)中，如果早注入胚胎時(shí)，移植針內(nèi)的液體不下行，是因?yàn)獒樇馀c子宮貼壁造成的，此時(shí)科適當(dāng)將移植針的針尖從子宮角內(nèi)提起一些，再慢慢推注；

9、移植的胚胎數(shù)量：移植的胚胎數(shù)量不能太多，如單側(cè)移植每次不能超過(guò)10枚，雙側(cè)移植不能超過(guò)25枚，移植太多對(duì)受體不好，甚至導(dǎo)致受體死亡

10、供受體發(fā)情同步：供體小鼠的發(fā)情與受體小鼠發(fā)情的同步性密切相關(guān)，是決定胚胎能否移植成功的關(guān)鍵，故受體鼠與結(jié)扎公鼠的合籠時(shí)間與供體鼠的見(jiàn)栓時(shí)間晚12-24小時(shí)，同步見(jiàn)栓者，移植效果不佳

11、麻醉：在進(jìn)行胚胎移植手術(shù)時(shí)，小鼠的麻醉程度不要太深，手術(shù)結(jié)束后，8h內(nèi)要禁食禁水。