科研狗做了一天的實(shí)驗(yàn)，本來(lái)高高興興。

實(shí)驗(yàn)試劑，復(fù)核，完美！

實(shí)驗(yàn)步驟，復(fù)核，完美！

實(shí)驗(yàn)儀器，復(fù)核，也完美！

但~~

難道，這就是傳說(shuō)中的水逆！？

科研狗都知道水逆是個(gè)玄學(xué)，但有時(shí)候水逆寶寶表示

那么到底是哪里出了問(wèn)題呢？其實(shí)有時(shí)候我們?cè)谌雍蜆颖颈４娴臅r(shí)候，一些細(xì)節(jié)問(wèn)題沒(méi)注意到，那么就會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)所有的努力白費(fèi)。特別是一些剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的熊孩子們，一頓操作猛如虎，一看結(jié)果全是哭！

好了，好了，小拓今天就來(lái)整理一下，一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)樣本保存方法及注意事項(xiàng)，包括：分子實(shí)驗(yàn)、蛋白實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、透射電鏡、生化檢測(cè)。

一、分子實(shí)驗(yàn)（RNA/DNA）

RNA提取（QPCR/測(cè)序等）

1.組織樣本

組織取材在組織離體 30min 內(nèi)完成，取樣的動(dòng)作要盡量快速利索，將組織切成任一方向小于 0.5 cm 的薄片（盡可能剪碎），抽取 1ml trizol 溶液于 2ml凍存管內(nèi)，將樣本完全浸沒(méi)于trizol溶液(如0.4g樣本需要約2.0 mLtrizol的溶液)。

液氮速凍后，-80 度保存。

注意：為完全有效的保護(hù)組織樣本，該組織樣本應(yīng)完全浸沒(méi)入 trizol 溶液中并且組織樣本的任何一邊的最大厚度不應(yīng)超過(guò) 0.5 cm。

2.細(xì)胞樣本

細(xì)胞收集后用PBS緩沖液快速洗一次，每5×10⁶個(gè)細(xì)胞加入1 ml trizol，用槍頭反復(fù)抽打，直至看不見(jiàn)成團(tuán)的細(xì)胞塊，整個(gè)溶液呈清亮而不粘稠的狀態(tài)；液氮速凍，-80 ℃保存。

3.血液樣本

1）加入1 ml TRIzol和 200-300μL新鮮血液（TRIzol：血液 = 3：1-5：1），用移液器吹打幾次以幫助裂解樣品中的細(xì)胞；

2）樣品劇烈震蕩混勻1~2 min，直到絮狀物全部溶解；

3）室溫孵育5 min以使核蛋白體完全分解；

4）寫(xiě)好編號(hào)，封口膜封存，-80 ℃凍存。

注意：冰凍血液溶解過(guò)程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此建議在冰凍前加入TRIzol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。

運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸

DNA提取

（1）組織樣本：取材后，PBS清洗2-3次，液氮速凍， -80 ℃保存

（2）細(xì)胞樣本：細(xì)胞收集沉淀后，液氮速凍， -80 ℃保存

運(yùn)輸條件：冰袋運(yùn)輸

二、蛋白實(shí)驗(yàn)（WB/ELISA）

組織樣本：取新鮮組織，用無(wú)塵紙快速吸去血液，將組織剪成小塊，放入裝有液氮的錫箔紙中速凍后，放入液氮預(yù)冷的離心管中，液氮速凍5min后，-80度保存。

細(xì)胞樣本：收集細(xì)胞懸浮液于1.5ml的離心管中，離心去上清，PBS洗滌三次，液氮速凍5min后，-80 ℃保存。

血清樣品：收集全血，室溫放置2h，4℃ 3000rpm/min 離心10min，吸取上部的血清即可，-80度保存。

運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸

全血：新鮮抗凝血，避免劇烈震蕩，避免凝血；立即提取。

三、病理實(shí)驗(yàn)

1.    石蠟切片

組織樣本：取材后，PBS 清洗 2-3 次，使用 4%多聚甲醛固定，組織樣本需完全浸泡在固定液中，固定液的容量應(yīng)足夠，一般固定液與組織塊的體積比率應(yīng)大于 10:1。室溫保存。

注意：取材樣本要新鮮，否則細(xì)胞內(nèi)溶酶體會(huì)破裂，造成細(xì)胞自融。

細(xì)胞樣本：細(xì)胞爬片后，4%多聚甲醛固定30min，換PBS浸沒(méi)4度保存。

運(yùn)輸條件：常溫運(yùn)輸

其他組織保存、固定等

2.    冰凍切片

取新鮮組織，PBS清洗2-3次后，立即用OCT包埋，-80度固定/保存。或者新鮮組織，PBS清洗后，-80度保存。

運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸

其他染色保存、固定等
 

3.透射電鏡樣本

3.1動(dòng)物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取樣組織2mmX2mm大小，盡量薄。如來(lái)不及修整組織大小可先于電鏡固定液內(nèi)固定半小時(shí)左右待組織變硬以后再修整組織進(jìn)行后固定。超出此范圍后組織會(huì)無(wú)法完全固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無(wú)法完成，務(wù)必請(qǐng)重視此過(guò)程。

② 取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。

③ 取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。4℃時(shí)樣本可保存1個(gè)月左右。

3.2細(xì)胞樣本

貼壁細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞連接，將培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基不經(jīng)漂洗迅速加電鏡固定液用細(xì)胞刮沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞收集到離心管內(nèi)（避免刮破細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹攸c(diǎn)觀察細(xì)胞器，對(duì)細(xì)胞形態(tài)形狀無(wú)特殊要求，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞要肉眼可見(jiàn)細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄固定液后加新的電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見(jiàn)細(xì)胞沉淀芝麻至綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過(guò)程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

四、生化實(shí)驗(yàn)

組織樣本：取新鮮組織，用PBS清洗去血液，將組織剪成小塊，放入凍存管中，液氮速凍5min后， -80℃保存

血清樣本：全血標(biāo)本室溫放置2小時(shí)3000rpm/min離心15min，-80℃保存。

血漿樣本:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃3000rpm/min離心15min， -80℃保存。

細(xì)胞樣本:收集細(xì)胞沉淀， -80℃保存

運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸

小提示：

1.血清與血漿的區(qū)別

注意：血清血漿顏色外觀無(wú)差別，不備注清楚無(wú)法肉眼分辨。

血清：全血中不加抗凝劑或加促凝劑，血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。

血漿：全血中加抗凝劑，血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體。

區(qū)別1：取血清不加抗凝劑；取血漿加抗凝劑。

區(qū)別2：血清中不含凝血因子；血漿中含凝血因子

2.實(shí)驗(yàn)用血清還是血漿

生化：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素抗凝血漿

ELISA：建議優(yōu)先選擇血清，其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿

凝血實(shí)驗(yàn)：只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿

血常規(guī)：只能選擇EDTA抗凝全血

3. 不同抗凝劑對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的影響

注意：有以下檢測(cè)指標(biāo)且需要用血漿的，請(qǐng)選擇相應(yīng)的抗凝劑

生化：EDTA對(duì)無(wú)機(jī)離子、堿性磷酸酶、肌酸激酶、超氧化物歧化酶檢測(cè)有影響；常規(guī)生化檢測(cè)可用肝素鋰抗凝血漿。

ELISA：常規(guī)指標(biāo)血清或EDTA及肝素抗凝血漿都可測(cè)，凝血相關(guān)指標(biāo)需用枸櫞酸鈉抗凝，以具體指標(biāo)為準(zhǔn)。

凝血四項(xiàng)：肝素及EDTA可能導(dǎo)致測(cè)不出來(lái)，只能用3.2%或3.8%枸櫞酸鈉抗凝：全血=1:9比例抗凝。

血常規(guī)：肝素影響白細(xì)胞計(jì)數(shù)，其他抗凝或多或少影響血細(xì)胞形態(tài)，EDTA為最佳抗凝劑，最佳濃度比為1.5mgEDTA：1ml全血